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1.
为了确定小麦转基因成分PCR和实时荧光PCR方法的定性检测低限,将转基因小麦B73与非转基因小麦(检测外源基因)、小麦与大米(检测内源基因)分剐进行质量分数配比后提取DNA用于测定相对检测低限,再将100%转基因小麦B73的DNA进行浓度稀释用于测定绝对检测低限,并应用已知的NOS、bar、ubiquitin,ui-dA(GUS)外源基因和肌Wx012、GAG56D内源基因的引物和探针时模板DNA分别进行PCR与实时荧光PCR扩增.结果表明,最终确定PCR方法检测小麦转基因成分的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.5 ng/ⅡL;实时荧光PCR方法的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.01 ng/μL.所确定的检测低限可满足国家对转基因产品的最低标识要求. 相似文献
2.
为了满足转基因小麦检测中对内源参照基因的检测要求,以小麦属特异的内源基因γ-醇溶蛋白基因（ GAG56D）作为目的基因,采用环状等温扩增技术(LAMP)建立了小麦内源基因 GAG56D的快速检测技术体系。针对小麦内源基因 GAG56D特异靶序列的6个区域设计4 条特异性引物,通过显色法进行LAMP检测,并对时间、温度等反应条件及反应灵敏度、特异性、稳定性进行探索。结果表明,该检测体系最适反应温度为63℃,反应时间 60 min,定性检测低限达到0.5%（w/w）。该检测方法具有高度的特异性、灵敏度和稳定性,操作简单、快速。 相似文献
3.
多重PCR快速检测甘蔗转基因成分研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以单子叶植物常见外源转基因元件Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列设计多重PCR引物,通过对PCR扩增体系中退火温度、Premix TaqTM浓度、引物浓度的优化,建立一种快速检测转基因甘蔗成分的多重PCR方法。结果表明:建立的体系一次能有效检测5个参数,其检测的最低DNA质量百分比可达1.0%,并在多个转基因甘蔗品种检测中得到验证。 相似文献
4.
多重PCR结合变性高效液相色谱技术转基因小麦检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为了满足对小麦转基因成分高通量快速检测的需要,建立了一种新的转基因小麦检测方法。通过对不同稀释倍数的转基因小麦品系B7361中的内源基因Wx012、外源基因ubiquitin、bar、nos、uidA进行单一PCR和多重PCR扩增,应用琼脂糖凝胶和变性高效液相色谱（DHPLC,denaturing high performance liquid chromatography）技术分离PCR 产物,进行灵敏度分析,并用非转基因小麦京花1号籽粒、大豆籽粒、麦片、转基因小麦B7361加工成的油炸制品为样本,对建立的检测体系进行检测。结果表明,样品经多重PCR扩增和DHPLC分离后,能够得到准确可靠的转基因图谱。与凝胶电泳方法比较,本研究所建立的多重PCRDHPLC具有更高的检测通量和灵敏度(能够同时检测5个基因,灵敏度达到1 ng·μL-1),能够满足小麦转基因成分的高通量快速检测的要求,同时也为转基因产品检测提供了一种新的技术手段。 相似文献
5.
以若干定性PCR方法部颁标准对含有0.5％的4份不同转基因混合样品进行检测,先以通用元件标准中的CaMV35s启动子、NOS终止子对混合样品进行初步定性PCR筛选。结果表明,4份样品中都含有转基因成分。Bt基因特异性标准检测表明,3#和4#样品含有转基因抗虫水稻成分。构建特异性标准PCR检测表明,2#、3#和4#样品含有转基因GTS-40-3-2大豆成分。以MON810、Bt176、NK603转化体事件标准进行品系特异性PCR检测,结果证实：1#和4#样品中含有Bt176转基因玉米成分;3#样品中含有Mon810转基因玉米成分;4份样品中均不含NK603转基因玉米成分。说明农业部颁布的定性PCR方法标准能满足于对多种转基因混合样品的检测,且检测结果准确,可靠。 相似文献
6.
抗虫玉米MON89034转化体特异性PCR检测技术研究 总被引：5，自引：2，他引：3
根据抗虫玉米MON89034外源插入片段5’端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,预期产物大小为455 bp。以zSSIIb基因作为内标准基因,建立了转基因玉米MON89034转化体特异性定性PCR检测方法。对该方法进行重现性、特异性和灵敏度测试,结果表明:该方法能够特异性检测出MON89034转化体,以100 ngDNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.1%,约为40个起始模板拷贝。复合PCR检测结果还表明,在同一PCR反应管中可实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测。 相似文献
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8.
为了培育高赖氨酸含量的小麦新材料,利用基因枪转化法将辣椒高赖氨酸蛋白Cflr基因导入到小麦品种扬麦16中,轰击了2 500枚小麦幼胚,获得抗除草剂Basta的再生植株176株(遗传转化采用的筛选标记基因为bar基因),经PCR鉴定Cflr基因阳性的转基因植株为23株.T1代幼苗喷洒130 mg·L-1的Basra溶液进行除草剂抗性鉴定,发现T1代幼苗的除草剂抗性出现了分离.PCR-Southern杂交进一步证明外源高赖氨酸蛋白基因Cflr基因已经整合到小麦的基因组中.通过种子赖氨酸含量和总蛋白质含量的测定,发现75.00％的转基因株系的赖氨酸含量高于受体扬麦16,77.78％的转基因株系的蛋白质含量高于受体扬麦16.本试验获得了一批赖氨酸含量提高的小麦转基因株系,这些高赖氨酸含量的转基因株系可进一步用于小麦高赖氨酸分子育种研究. 相似文献
9.
穗茎注射法导入反义PLDγ基因小麦的分子检测 总被引：2，自引：1，他引：1
利用穗茎注射法将反义PLDγ(Antisense phospholipase Dγ)基因导入普通小麦兰考906,并用特异PCR标记和PCR-southern杂交技术对所获得的变异系进行了分子检测,旨在探讨该基因在小麦中的整合效果。结果表明:(1) 经反义PLDγ基因的特异PCR标记,变异系03039、03048和03050扩增出与阳性质粒大小相同的400 bp的目的片断,PCR-southern杂交结果与其一致。说明该基因已整合到小麦的基因组中,从而获得了转反义PLDγ基因的小麦。(2) 转基因株系的成熟期比对照提前4～8 d,后代中易产生雄性不育现象。 相似文献
10.
本研究成功建立了商业化种植的转基因玉米MON810的筛选检测和品种鉴定的PCR方法.该方法根据玉米自身IVR基因作为内源特异参照基因扩增226 bp片段,检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果;同时扩增CaMV35S启动子基因195 bp片段,可以对MON810转基因玉米进行筛选检测;此外,根据MON810品种设计的特异性鉴定检测引物,可扩增Maize genome/CaMV35S基因170 bp片段和HSP/CryIA(b)基因194bp片段,具有很强的品种特异性,达到了对MON810转基因玉米的品种鉴定目的.PCR反应循环参数是94℃2 min;94℃40sec,55℃60sec,72℃60sec,35次循环;之后72℃延伸5 min。 相似文献
11.
转抗除草剂基因小麦植株的筛选方法研究 总被引：2，自引：0，他引：2
为了降低小麦转bar基因时产生较高比例的假阳性植株,采用测定T0代转基因植株叶片释放NH4 浓度和对T1代植株喷施Basta除草剂等辅助筛选方法,建立了简便有效的转bar基因小麦筛选体系。研究结果表明,2叶期和5叶期叶片释放的NH4 浓度与bar基因PCR检测结果呈极显著相关,相关系数分别为0.86和0.75。对391株T0代再生植株进行叶片释放NH4 浓度测定,筛选到34株转基因植株,其中27株为bar基因的PCR检测所证实。用100 mg/L Basta除草剂对381株T0代植株的后代(3 800余株)进行喷施筛选,根据后代抗性分离筛选到13株T0代阳性植株,与PCR检测结果吻合度达到100%。这两种方法可用于以bar基因为选择标记基因的转基因植株的筛选。 相似文献
12.
B组醇溶蛋白是大麦的主要贮藏蛋白之一,其组成及含量与大麦的营养品质和加工品质密切相关。为探究大麦B组醇溶蛋白对小麦面粉加工特性的影响,以转青稞B-hordein基因的小麦转基因高代株系(T4、T5代)及其受体品种龙麦30为材料,分别对转B-hordein基因小麦高代株系及龙麦30进行分子检测、农艺性状测量、近红外分析和粉质分析。结果表明,转B-hordein基因小麦高代植株均为阳性植株;在农艺性状方面,转B-hordein基因小麦与龙麦30无显著差异;在品质方面,转B-hordein基因小麦的蛋白质含量、湿面筋含量的平均值均极显著高于龙麦30;粉质分析结果也表明转B-hordein基因小麦的粉质参数优于龙麦30。由此推测,B-hordein基因的成功转化能够改善小麦的面粉加工特性。 相似文献
13.
外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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将组成型表达的玉米泛素启动子与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI连接,插入根癌农杆菌双T-DNA质粒,构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg;另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体,用以转化农杆菌菌株,再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选,用特异PCR扩增和Southern杂交检测,从分化再生的T0代植株中,鉴定出7个转化CpTI基因的阳性植株。目前,正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定,培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。 相似文献
16.
为了验证小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A5在小麦籽粒发育中的功能,对pINO启动子驱动的TaCYP78A5基因过表达的转基因小麦后代株系进行了鉴定,检测了T_0代植株目标基因拷贝数,定量分析了7个T_1代阳性植株的目标基因表达,并对其籽粒大小进行了统计。结果表明,利用Bar试纸条和目标基因特异PCR检测相结合的方法对21株转基因T_0代再生苗进行检测,共鉴定出14个阳性植株,除2个植株的目标基因拷贝数为3和1个植株为7外,其余11个T_0代转基因植株目标基因插入拷贝数均为1~2个,其中有6个单拷贝植株。与野生型相比,7个T_1代阳性植株目标基因表达量均极显著增加,粒厚和粒宽均有不同程度增加,粒重极显著增加。 相似文献
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基因枪法介导转人工合成Rs-AFP2基因小麦的获得和检测 总被引：3，自引：1，他引：3
萝卜（Raphanus sativus）抗菌肽Rs—AFP2在体外强烈抑制小麦赤霉病菌（Fusarium graminenrum）、黄色镰孢菌（Fusarium culmorum）、烟草赤星病（Alternaria longipes）的菌丝生长。为了研究Rs-AFP2在小麦抗病育种上的应用潜力，人工合成了Rs-AFP2基因。通过基因重组技术（包括限制性内切酶酶切和连接），将人工合成的R以FP2基因替代单子叶高效组成型表达栽体pAHC25中的GUS基因，构建了R￡AFP2基因的单子叶高效表达栽体pUAFP2。该栽体除携带受Ubiquitin启动子控制的Rs-AFP2基因表达盒外，还具有1个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒，后者可为后续利用除草剂Bialaphos筛选转化再生植株提供抗性；采用基因枪法轰击小麦品种扬麦12、济麦19、晋麦47和豫麦34幼胚共4042个，经过2～3次Bialaphos筛选，最终获得扬麦12再生植株316株；利用高效表达栽体pUAFP2的Bar和Rs-AFP2基因的特异引物对上述成活的转化植株进行PCR检测，获得Bar和Rs-AFP2基因均为阳性的植株58株，转化率为1．43％。 相似文献