共查询到20条相似文献，搜索用时 562 毫秒
1.
pBI121-Lyz-GFP表达载体的构建及其在和田苜蓿愈伤组织中的转化 总被引：3，自引：0，他引：3
将绿色荧光蛋白(GFP)基因片段插入到pBIl21-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBI121-Lyz-GFPo经Sma Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750 bp的目的片段,通过进一步测序证明,GFP基因已成功地连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确.利用冻融法将重组质粒导人根癌农杆菌(Agrobactcrium tumenfaciens)LBA4404,用叶盘法转化和田苜蓿(Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye),筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明,重组基因已成功地转化到和田苜蓿愈伤组织中. 相似文献
2.
为建立和优化节瓜的遗传转化体系,并高效地完成CqWRKY1基因的遗传转化,本研究以节瓜A39为材料,通过RT-PCR技术克隆了节瓜CqWRKY1基因,采用Gateway同源重组法构建了pEarleyGate101-CqWRKY1超表达载体,以节瓜子叶节为外植体,利用农杆菌介导的遗传转化法进行转化。结果表明,子叶节不定芽诱导的最适培养基为MS+0.5 mg·L~(-1)6-BA+1 mg·L~(-1)ABA,诱导率可达76.17%;生根的最佳培养基为1/2MS+0.5 mg·L~(-1)IAA;农杆菌侵染的最佳条件为农杆菌浓度OD_(600)为0.3、侵染时间为10 min、共培养时间为3 d;最佳的抑菌抗生素为500 mg·L~(-1)的头孢霉素。本研究在181株拟转基因组培苗中共得到76株阳性T_0转基因组培苗,其中共有37株移栽成活。PCR结果表明,CqWRKY1已成功整合到37株转化植株的基因组中。本研究结果为进一步研究CqWRKY1基因的功能奠定了一定的理论基础。 相似文献
3.
<SPAN style= 《农业生物技术学报》2007,15(1):85-89
利用PCR的方法从油菜(Brassica napus)基因组中扩增得到花瓣特异性启动子XY355，将XY355与玉米花青素调节基因Lc融合构建植物表达载体pXY60。用冻融法将pXY60转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后以烟草（Nicotiana tabaccum L.）和矮牵牛（Petunia hybrida）的叶盘为外植体，通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化。对再生植株的PCR检测证明外源基因已经整合到转基因烟草和矮牵牛的基因组中。对转基因烟草和矮牵牛的表型进行观察：转Lc基因烟草的花色由浅红变成了红色，转Lc基因矮牵牛的花色由白色变成了浅紫色。 相似文献
4.
农杆菌介导法获得大量转双价抗虫基因水稻植株 总被引：21，自引：0，他引：21
构建含Bt杀虫基因cryIA(c)和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI的双价抗虫转基因载体PCAM-Bt-CpTI，并用于农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导法对粳稻品系“浙大19”遗传转化，约2000块盾片愈伤组织与农杆菌共培养后，得到了约1300块潮霉素抗性愈伤，从中分化抗性再生苗约1500株，对不同抗性愈伤来源的70个T0代再生株进行PCR及PCR-Southern检测，62株为转cryLA(c)和CpTI双价抗虫基因植株，阳性植株比例为88.6%，抗虫鉴定表明，3个转基因T1代株系对二化螟有很高的毒性。 相似文献
5.
构建番茄红素β/ε环化酶基因RNAi植物表达载体及其表达分析 总被引：2，自引：1，他引：1
根据GenBank中Lyc-β基因(X86452)及Lyc-ε基因(Y14387)设计引物,通过高保真PCR从番茄cDNA中克隆到两段长度为302和330bp的Lyc-β基因片段和两段长度为302和288bp的Lyc-ε基因片段。从质粒pCAMBIA-2301(AF234316)克隆出gusA基因长度为168和235bp的2个内含子片段。根据RNAi原理将正、反向序列与内含子连接,之后插入启动子与终止子之间构建成4组植物表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草植株,通过PCR鉴定共获得107株转基因植株。利用荧光定量PCR分析干扰效果,结果显示经4组干扰载体干扰后,转基因植株中目的基因mRNA含量分别为对照的3.4%、16.4%、15.2%和21.8%。进一步用HPLC对应分析转化株的番茄红素含量,结果表明转基因植株中番茄红素平均增长量分别为3.4、2.1、3.4和2.0μg/g。同时测定转基因植株中的β-胡萝卜素与叶黄素含量,发现它们根据干扰的基因不同呈现对应的变化。 相似文献
6.
《核农学报》2010,24(3):482-489
根据GenBank中Lyc-β基因 (X86452) 及Lyc-ε基因 (Y14387) 设计引物,通过高保真PCR从番茄cDNA中克隆到两段长度为302 和330bp的Lyc-β基因片段和两段长度为302 和288bp的Lyc-ε基因片段。从质粒pCAMBIA-2301 (AF234316) 克隆出gusA基因长度为168 和235bp的2个内含子片段。根据RNAi原理将正、反向序列与内含子连接,之后插入启动子与终止子之间构建成4组植物表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草植株,通过PCR鉴定共获得107株转基因植株。利用荧光定量PCR分析干扰效果,结果显示经4组干扰载体干扰后,转基因植株中目的基因mRNA含量分别为对照的3.4%、16.4%、15.2%和21.8%。进一步用HPLC对应分析转化株的番茄红素含量,结果表明转基因植株中番茄红素平均增长量分别为3.4、2.1、3.4和2.0μg/g。同时测定转基因植株中的β-胡萝卜素与叶黄素含量,发现它们根据干扰的基因不同呈现对应的变化。 相似文献
7.
水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体的构建及遗传转化研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究水稻热激转录因子基因OsHsfA7的功能及其在水稻耐热育种方面的应用价值,本文通过构建水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体获得功能抑制变异材料,从反向遗传学进行基因的功能分析。扩增OsHsfA7c DNA3'编码区470bp片段,分别以反向和正向插入到中间载体pBSK连接的GUS片段两侧,然后将得到的RNA干扰片段克隆到改造的植物表达载体p1301M,构建以CaMV35S启动子驱动表达的水稻OsHsfA7基因RNA干扰表达载体。将该载体转入根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行了水稻日本晴品种的遗传转化,获得了23株具有潮霉素抗性的转基因植株,其中12株经GUS染色呈蓝色并且DNA检测10株已插入目的片段,RNA检测其中6株OsHsfA7基因的表达水平下降甚至未检出。结果说明本研究构建的OsHsfA7基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的。 相似文献
8.
柴燕文 《农业生物技术学报》2008,16(5)
利用分子克隆技术,将GFP基因片段插入到pBI121-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBI121-Lyz-GFP。经SmaI与BamHI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明：GFP基因已成功连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌菌株LBA4404,用叶盘法转化和田苜蓿,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明重组基因已成功转化到和田苜蓿愈伤组织中。 相似文献
9.
番茄红素β环化酶基因（Lyc-β）RNAi载体构建及表达鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从番茄(Lycopersicun esculentum Mill)提取总RNA,根据GenBank中番茄红素β环化酶基因(Lye-β)序列(X86452),经mRNA反转录扩增出2段Lyc-β基因高度保守的300 bp DNA 片段,从β-葡萄糖苷酶基因(gusA)中扩增出170 bp的内含子片段.分别将两段不同的Lyc-β片段的正、反向序列与内含子连接,构建出两套干扰Lyc-β基因的植物表达载体.经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciems)介导转化番茄,22 株转基因植株通过荧光定量PCR分析干扰效果,结果显示,2套干扰载体的干扰效率表现出一定的差异,Lyc-β基因mRNA平均含量分别为对照的11.78%和13.86%,进一步用HPLC分析转化株的番茄红素含量,结果表明,转基因植株中番茄红素的含量最高可达13.84 μg/g FW,是对照的4.26倍. 相似文献
10.
植酸是植物种子中肌醇和磷的主要存在形式,由于单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶,以植酸磷形式存在的磷难以被单胃动物吸收。植酸酶作为饲料添加剂已经广泛应用,但在食品中的应用研究刚刚开始。本研究以黑曲霉(Aspergillus niger)CICC2462基因组DNA为模板,PCR扩增植酸酶基因片段,并在其两端加上糖化酶基因(glaA)的5'同源臂和3'同源臂,构建农杆菌Ti质粒基因置换载体pSZHG-phy。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化黑曲霉,筛选以植酸酶基因替换糖化酶基因的同源重组转化子,以实现植酸酶基因的高效表达。结果表明,筛选获得4株同源重组转化子,同源重组率为100%,通过分光光度计法测定重组植酸酶菌株的最高发酵酶活为316.2 U/mL,为出发菌株的20.8倍,证明植酸酶phy基因是可以在黑曲霉糖化酶生产菌中实现高效表达。本研究为进一步构建食品级植酸酶工程菌提供了基础资料。 相似文献
11.
GDA2基因的克隆、原核表达与融合蛋白的纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：GDA2（G2 pea dark accumulated gene）是与G2豌豆（Pisum sativum L.）短日照条件下不衰老现象紧密相关的基因之一。实验用cDNA差示分析法（representational difference analysis, RDA）得到一个短日照下特异表达的G2豌豆cDNA，并命名为 GDA2。核酸序列分析表明，该cDNA全长1 120 bp，最大的开放阅读框为642 bp，编码一个由213个氨基酸构成的分子量约为24 kD的蛋白质，与GDA1的同源性为36%。在GDA2的cDNA两端分别引入Bgl Ⅱ与XhoⅠ的酶切位点，用PCR方法将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经过酶切筛选和测序鉴定，得到所需的表达载体pGEX-GDA2。将pGEX-GDA2导入E.coli BL21菌株，经IPTG诱导，得到分子量约51 kD的 GST-GDA2融合蛋白，并利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱对该融合蛋白加以纯化。GDA2-GST融合蛋白的表达和纯化工作，为深入研究GDA2蛋白的结构与功能以及该基因同衰老的关系打下良好的基础。 相似文献
12.
向日葵种子特异性启动子Ha ds10G1的克隆及其功能验证 总被引：3，自引：0，他引：3
利用PCR技术从向日葵基因组DNA中克隆了Lea蛋白基因家族中Ha ds10 G1基因上游1414bp的调控序列，序列分析表明-1—1414bp与报道序列同源性为100%，将其与GUS基因融合构建植物表达载体后，通过农杆菌介导法转化烟草NC89，PCR扩增初步证明目的片段已整合到烟草基因组中，转基因植株的GUS活性检测表明，在茎、叶中无GUS活性，GUS活性只存在于种子中，因此，Ha ds10 G1启动子具有种子特异性的功能。 相似文献
13.
Characterization of the transgenic rice event TT51-1 and construction of a reference plasmid 总被引：2，自引：0，他引：2
Cao Y Wu G Wu Y Nie S Zhang L Lu C 《Journal of agricultural and food chemistry》2011,59(16):8550-8559
Transgenic rice TT51-1 (BT63) is an insect resistant strain that was granted for safety certificate in China in 2009. This study characterizes the transgenic event TT51-1 using a GenomeWalker strategy. The organization of the transgenes indicated that the transgenes on two plasmids, pFHBT1 and pGL2RC7, had been integrated at the same locus. The sequence of the event TT51-1 spanned 8725 bp, including a truncated Cry1Ab/Ac cassette, an intact Cry1Ab/Ac cassette, two Amp gene segments, and an Hph gene segment. The 5' and 3' plant flanking sequences were isolated and used to locate the transgenes to chromosome 10 in TT51-1. The isolated TT51-1 fragment and a fragment of the rice PLD gene were integrated into a plasmid vector, to create plasmid pK-TT51 as a calibrator for detecting rice containing TT51-1. Analysis of unknown samples indicated that the reference plasmid was a reliable alternative to TT51-1 genomic DNA. 相似文献
14.
紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。 相似文献
15.
摘要： 利用PCR技术获得6个不同长度的玉米In5-2启动子5'端缺失片段，分别克隆到植物表达载体p1301后转化烟草。GUS活性定量检测结果显示，玉米In5-2的基础转录区域可能位于ATG上游-1 520~-1 431 bp之间。利用DNAMAN软件分析在-1 108~-1 079 bp和-891~-864 bp之间存在着2个茎环结构，推测茎环结合蛋白位点可能位于-1 079~-897 bp之间，且ATG上游-388~-86 bp之间可能存在乙酰苯胺类化合物诱导元件。 相似文献
16.
通过染色体步移法从小金海棠（Malus xiaojinensis）基因组中克隆了三价铁螯合还原酶（ferric chelate reductase, MxFRO2）基因翻译起始位点上游1 738 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在光响应元件G-box、生长素应答元件、铜元素响应元件、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。从TAIR网站获得了拟南芥（Arabidopsis thaliana）中8个FRO基因上游的启动子序列,通过PlantCARE分析了其与MxFRO2启动子的异同。根据在线预测结果,克隆了翻译起始位点上游1 644 bp（MxFul）和259 bp（MxD1）两段序列,构建了其与GFP融合的瞬时表达载体,并将重组质粒通过PEG介导法分别转化拟南芥叶片原生质体,结果表明,小金海棠MxFul和MxD1两段启动子序列都能驱动GFP蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达。 相似文献
17.
水稻OsWRKY19基因启动子的分析 总被引：2，自引：0，他引：2
利用PCR技术从水稻(Oryza sativa)秀水11品种中克隆了转录因子WRKY19编码区5'上游大小为1 404 bp的调控序列，命名为OsW19p, 将它和长度为105、378、977、1 106、1 205和1 306 bp的5'端缺失体分别与gus基因融合，构建植物表达载体。用根癌农杆菌介导法将所有载体转化水稻，GUS组织化学分析和荧光测定结果表明：(1)培养基中的2,4-D强烈抑制 gus基因在愈伤组织阶段的表达；(2) gus基因在转基因植株的根、茎、叶和花中均有表达，在花粉和成熟种子中无表达，在种子萌发时胚有表达，在苗期种子根和不定根及它们的侧根均有表达但根尖无表达，成熟期根部只有侧根有表达；(3)除p105以外OsW19p (p1404)和其它5个不同长度的缺失体均可驱动gus基因在转基因苗叶片中的表达，p1205活性最高，p977和p1306的活性减弱,由此推测-1404～-1306 bp和-1205～-977 bp间包含正调控元件，-1306～-1205 bp和-977～-378 bp间包含负调控元件。 相似文献
18.
Efficient production of active recombinant Candida rugosa LIP3 lipase in Pichia pastoris and biochemical characterization of the purified enzyme 总被引：1，自引：0，他引：1
Candida rugosa lipase (CRL), an important industrial enzyme, possesses several different isoforms encoded by the high-identity lip gene family (lip1 to lip7). In this study, an additional N-terminal peptide in front of the lip3 gene was removed by PCR, and the 18 nonuniversal serine codons (CTG) of the lip3 gene were converted into universal serine codons (TCT) by means of an overlap extension PCR-based multiple-site-directed mutagenesis to express an active recombinant LIP3 in the yeast Pichia pastoris. The regional synthetic DNA fragment (339 bp) is first recombined by primer assembly with 20 overlapping nucleotides, followed by specific overlap extension PCR with outside primers containing restriction enzyme sites for directional cloning into the pGAPZalphaC vector. The results show that the production yield (0.687 unit/mL) of N-fused lip3 (nflip3) has an overall improvement of 69-fold relative to that (0.01 unit/mL) of lip3 and of 52-fold (0.47 unit/mL) of codon-optimized lip3 (colip3) relative to that (0.01 unit/mL) of non-codon-optimized lip3 (lip3), with the cultivation time set at 5 days. This finding demonstrates that the reservation of the N terminus and the regional codon optimization of the lip3 gene fragment at the 5' end can greatly increase the expression level of recombinant LIP3 in the P. pastoris system. The purified recombinant LIP3 shows distinct biochemical properties compared with other isoforms. 相似文献
19.
棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。 相似文献
20.
Class-Ⅰ KNOX(KNOX1)基因是真核生物中高度保守的同源盒转录因子,在植物的器官和胚胎发生中起着重要作用。本研究从狗蔷薇(Rosa canina L.)的类原球茎中克隆出了其同源基因,通过对其编码的蛋白质序列比对和系统发育分析,认为其属于KNOX1 在狗蔷薇中的同源基因;该基因全长 1 509bp,其中编码区 1 185 bp,编码 395 个氨基酸,将其命名为 RcKN1 基因 (GenBank 登录号:JN998201)。RT-PCR分析表明,其在叶芽、花芽、类原球茎等幼嫩的器官中表达;进一步构建了组成型表达载体并导入烟草(Nicotiana tabacum L.)中分析其功能,转基因烟草出现了叶片浅裂、叶脉紊乱、叶片基部歪斜、叶片皱缩甚至类似于复叶的叶片等多种表型。研究结果表明,RcKN1 基因在植物发育中起着重要作用,是研究叶片发育机理和培育叶型奇特的花卉新品种有价值的目的基因。 相似文献