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丝毛乌骨鸡胸肌和肝脏cDNA文库的构建与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
了解肌肉组织和肝脏组织的基因类型,构建鸡肌肉组织和肝脏组织的功能基因表达谱在动物遗传育种中具有重要的意义.为比较基因组学的研究、功能基因组学的研究、QTLs定位等的动物分子育种做前期基础科研工作,研究以丝毛乌骨鸡(Gallus gallus)的胸肌和肝脏为实验材料,以Lambda ZAPⅡ为载体,构建了胸肌和肝脏的cDNA文库.同时,对这两个cDNA文库进行了噬菌体PCR鉴定和所提质粒的EcoRⅠ和XhoⅠ的双酶切鉴定.结果表明,胸肌和肝脏mRNA的OD260/OD280分别为1.92和1.90.胸肌cDNA文库的滴度在3.6× 107 pfu/mL以上,重组率92%以上,插入片段平均大于1.5 kb.肝脏cDNA文库的滴度在3.4× 107pfu/mL以上,重组率90%以上,插入片段平均大于1.4kb. 相似文献
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为了研究盐生植物耐盐基因表达调控,本实验以海水浇灌的海马齿植株为供试材料,构建了盐胁迫下的全长cDNA文库。构建方法如下：采用改良的CTAB法提取总RNA,SMART法反转录合成cDNA,LD-PCR方法合成双链cDNA。LD-PCR产物经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后,经CHROMA SPIN＋TE-1000分离柱子除去小片段DNA后,回收0.5kb以上的片段,按照适当的比例连接λTripIEX2载体。连接产物利用MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts进行体外包装,得到海马齿初级cDNA文库。初始文库的独立克隆数为2.4×106pfu,初级文库滴度大于4.80×106pfu/mL,重组率为93.75%,插入片段为0.5～5kb,扩增文库的滴度为1.21×109pfu/mL,所得文库质量较高。本研究表明该cDNA文库适合于盐生植物海马齿相关基因的克隆和分析。 相似文献
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采用人工土壤法，研究重金属镉(Cd2+)对成熟赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）的急性毒性,表明蚯蚓对镉具有较强的耐受性。Trizol法提取蚯蚓RNA后，采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒，成功构建了低剂量Cd2+（200 mg•kg-1）诱导的蚯蚓cDNA文库，其库容量为3.02×105 pfu/mL,扩增后滴度为8.67×109 pfu/mL，重组率为97.3％, 绝大多数的cDNA插入片段≥0•5 kb,平均长度≈1•0 kb。所够建的cDNA质粒文库容量及插入片段大小符合合格文库要求, 为进一步筛选蚯蚓体内解毒、免疫相关基因，寻找生物标志物奠定了基础。 相似文献
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华东葡萄白河-35-1株系抗霜霉病基因cDNA文库构建及EST分析 总被引：1，自引：0，他引：1
以中国原产抗霜霉病葡萄野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）白河-35-1为材料,用SMARTTM技术构建葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）诱导的葡萄叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度0.92×106 pfu/mL,重组率97%,插入片段500～2 200 bp,扩增文库滴度为5×109 pfu/mL。随机挑取克隆5'端测序,获得254条有效EST序列（GenBank登录号：FG269201~FG269449和FG396006~FG396010）。经BlastX分析,有56.3% ESTs与GenBank中功能已知基因有较高同源性,14.6%ESTs与功能尚未确定的假设蛋白或未知蛋白同源性很高,20.9%ESTs在GenBank中无匹配的同源产物。 相似文献
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欧李叶片全长cDNA文库的构建和部分克隆的序列分析 总被引：4，自引：1，他引：3
采用SMART技术,构建了欧李(Prunus humilis Bunge)品系T8-1叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达6.17×10~7 pfu/mL,库容达3.7×10~7,重组率达95%,平均插入片段大小约为1.2 kb.随机挑取400个单克隆进行5'端测序,共获得364个欧李ESTs.绝大部分ESTs的长度在500～1300 bp之间,平均长度为877 bp,其中具有完整ORF结构的序列有221条,占60.71%.通过与NCBI等非冗余核酸数据库和蛋白质数据库进行比对、查询和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因181个(339个ESTs),相似性较低的未鉴定基因5个(9个ESTs),新基因14个(16个ESTs). 相似文献
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FLOWERING LOCUS T(FT)是调控植物开花途径中的关键基因,前期研究中,在比较晚开花wym-97和早开花cx-49两个品种的BcFT启动子时,发现cx-49的BcFT启动子存在一个1 577 bp的插入片段。为探索该插入片段对不结球白菜开花的影响,本研究构建不结球白菜酵母杂交cDNA文库,继而利用酵母单杂交技术筛选与BcFT启动子互作的蛋白。结果显示,本研究所得cDNA文库的库容为1.8×106 CFU,重组率为100%,插入片段长度分布范围约400～2 000 bp,平均长度大于1 000 bp,表明不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建成功。自激活试验表明,800 ng·mL-1的金担子素(AbA)可以抑制诱饵载体的自激活。通过酵母单杂交试验筛选到结合BcFT启动子插入片段的上游蛋白BcSAP18和BcDEAR2。综上,本研究成功构建了不结球白菜酵母杂交cDNA文库并获得了BcFT启动子插入片段的互作蛋白,为进一步研究BcFT在不结球白菜开花中的调控机制奠定了基础。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性 总被引：2，自引：0，他引：2
RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S蛋白基因5'端包含 B、C抗原位点的1.0 kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5'端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay, IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为107. 7TCID50/mL。动物免疫试验显示, rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。 相似文献
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将鸡Leptin成熟肽的cDNA片段插入表达载体pRSET A的Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ两位点之间，构建重组表达质粒pLep -SCAU2并转化大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21（DE3）, 将重组菌在含氨苄青霉素100 μg/mL 的LB培养基中培养至OD600大于0.6之后，经IPTG 0.05 mol/L诱导表达出分子量约为17.5 kD的含6×His标记的重组鸡Leptin，诱导4 h后表达量达最高，占总菌体蛋白的25％左右,且以包涵体形式存在。该重组鸡Leptin经50％Ni-NTA树脂纯化和透析复性折叠后分离出可溶性部分。对35日龄的矮脚黄鸡腹腔注射该可溶性重组鸡Leptin（2 mg/kg 体重）；注射后60 min内的采食量与对照组差异不显著 （P > 0.05），但在注射后80~120 min都显著低于对照组（P < 0.05）。Leptin处理公鸡的采食量在注射2 h后逐渐上升并在5.5 h时与对照组公鸡相同。但Leptin处理母鸡的采食量持续受到抑制，在注射后5.5 h时仍然显著低于对照组母鸡（P <0.01）。表明所表达的重组鸡Leptin能显著抑制鸡的采食量（母鸡比公鸡效果更为明显），证明所制备的重组鸡Leptin融合蛋白具有生物学活性。 相似文献
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长穗偃麦草是小麦的野生近缘植物之一,具有抗多种生物胁迫和非生物胁迫的优良基因。为了从中发掘耐盐基因,分别用100、200、300、400 mmol·L~(-1)的Na Cl和20%、30%、50%(w/v)的PEG-6000处理长穗偃麦草幼苗,采用改良的SMART方法合成逆境诱导条件下的全长c DNA。采用Gateway技术中的BP反应构建长穗偃麦草全长入门c DNA混合文库,滴度为4.0×106cfu·m L~(-1),库容量为2.0×107cfu,插入片段平均长度为0.75 kb,重组率达98.9%。将该入门文库重组到植物转基因双元载体p MDC83中,获得目标文库,其原始滴度为6.0×106cfu·m L~(-1),库容量为3.0×107cfu,插入片段平均长度为0.45 kb,重组率达100%。通过农杆菌侵染萌发花粉再授粉的方法,获得转基因玉米T0种子,转化率达3%;用农杆菌侵染法将农杆菌与烟草BY-2细胞共培育,成功将目标文库转入到烟草BY-2细胞中,在培养基中加入潮霉素和不同浓度的Na Cl溶液,筛选获得耐盐细胞系69个。研究结果为大规模快速筛选鉴定植株水平和细胞水平上的抗盐基因奠定了基础。 相似文献
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松墨天牛（Monlchamus alternatus Hope）是林业重大害虫。本研究运用SMART技术构建了松墨天牛幼虫cDNA文库,库容量为1.09×10^6,文库滴度为5.45×10^6 pfu/mL,重组率为97.8%,平均插入片段大小约为1 000 bp,构建的文库质量较好。随机选取1 022个克隆进行测序,获得了1 012条表达序列标签（ESTs）,序列在GenBank中登录号为JZ143720～JZ144731。EST序列经过聚类拼接得到411条非重复单一序列,其中216条序列有功能注释。在216条有功能注释的序列中,有181条（83.80%）参与＂分子功能＂,122条（56.48%）参与＂细胞成分＂,168条参与＂分子生物学过程＂（77.78%）。研究结果为克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基础。 相似文献
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利用稻瘟病菌(Magnaporthegriesa)连续6个发育时期的材料构建了一个混合cDNA文库。文库滴度,重组率和插入片段长度等质量分析表明,构建的文库包含完整的稻瘟病菌基因,可用于病菌基因表达分析。利用该文库获得了7456条5′端表达序列标签(ESTs)(GenBank收录号:(CK909944￣CK913666和CK928583￣CK932582),生物信息分析表明:EST序列拼接出2975个假定独立转录本(TUTs),冗余度为60.1%;从cDNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因,约占TUT总数的79.8%,说明在文库中基因组成类型的复杂性较高;在所有TUTs中,功能未知基因约占85.5%,编码ECM33蛋白和疏水蛋白等病菌致病相关的注释基因高丰度表达,进一步表明该cDNA文库反映了病菌侵染和发育过程中基因表达的状况。 相似文献