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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)可以引起猪生殖和呼吸道疾病、断奶仔猪综合征、皮炎和肾炎等，给全球养猪业造成了严重的经济损失。快速、精准的检测方法对该病毒的防控尤为重要。对近年来国内外已发表的PCV2快速检测方法的原理、特点及检测应用进行综述，主要介绍了基于PCR的检测方法(常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR、多重PCR、纳米PCR、数字PCR及其他基于PCR的方法)、核酸等温扩增技术(环介导等温扩增、重组酶介导等温核酸扩增、重组酶聚合酶扩增)、基因芯片、原位杂交、液相芯片系统以及免疫学检测方法(免疫层析技术、酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验、斑点测点法、表面等离子体共振技术)。此外，也对相关方法的未来发展方向进行了展望，以期为我国有效防控PCV2传播和感染提供科学而全面的参考。 相似文献
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同时检测CSFV、PRRSV的二重RT-PCR方法的建立及其在临床样品检测中的初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
建立了1种一步法RT-PCR用于同时检测典型猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖呼吸道综合征病毒(PRRSV)的多重PCR诊断方法(Multiplex PCR,mPCR)。根据Genbank上公布的CSFV、PRRSV基因组全序列及部分序列,借助DNAStar和Oligo6.0基因序列和引物设计软件,设计2对特异性引物分别用于扩增CFSV、PRRSV病毒777bp和434bp的目的片断。该mPCR由RT反应和PCR反应构成。将病毒核酸连接到PMD18-T载体,提取质粒后,以10倍进行倍比稀释,取每个稀释度的病毒核酸进行mPCR反应,对CSFV、PRRSV的最低检测量分别为8.5pg、8.3×10-2pg。以PCV2、PCV1、PPV、PRV、SIV、E.coil和双蒸水为模板进行mPCR反应,扩增结果均为阴性,表明该mPCR具有较好的特异性。对临床样品的检测表明,本研究建立的mPCR诊断方法能够对CSFV和PRRSV进行快速的诊断,同时对CSFV、PRRSV在猪群中的流行病学调查也具有十分重要的意义。 相似文献
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检测与诊断猪圆环病毒PCR技术的建立及病毒的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究建立了检测与诊断猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究。该方法快速、敏感、特异性强,可扩增10ng的阳性质粒的DNA,可以从30μL病料组织悬液或全血中扩增检测出PCV,并且该方法可以区分PCV1和PCV-2,对其它病原微生物如PPV、PRRSV、SIV以及许多细菌不能检出。应用此方法对6省市的12个猪场的225份病料进行了检测,对阳性病料进行了病毒分离,对分离的病毒进行了电镜观察与序列测定,结果证实分离的病毒为PCV-2。 相似文献
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为建立十足目虹彩病毒1的快速检测方法,根据十足目虹彩病毒1的ATP酶基因(ORF114R)保守序列设计特异性引物,通过条件优化,建立基于重组酶聚合酶扩增技术的十足目虹彩病毒1检测方法。重组酶聚合酶扩增技术的最优扩增温度为30 ℃,恒温反应20 min内即可完成。特异性试验结果显示,该方法与其他常见虾类感染病毒无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法对十足目虹彩病毒1的最低检出限为7 拷贝/μL,低于传统的巢式PCR方法。利用已建立的重组酶聚合酶扩增技术方法和PCR方法对采集的509批临床样品进行检测,试验结果表明,重组酶聚合酶扩增技术能够有效检出PCR方法的弱阳性样品,表明重组酶聚合酶扩增技术可以用于临床检测。笔者建立的检测十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术具有快速、简便、特异性强、灵敏度高的特点,适合基层实验室及现场检测。 相似文献
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[目的]利用PCR技术,探究鸡毒支原体(MG)的检测方法。[方法]针对MG脂蛋白的基因序列,建立PCR扩增体系,测定其灵敏度和特异性,并对鸡胚样品进行检测。[结果]PCR扩增得到了400bp的基因片段,最低检出浓度为0.2 pg·μL~(-1);该PCR法仅与MG的DNA反应,与大肠杆菌、猪肺炎支原体、新城疫病毒、沙门氏菌的DNA或cDNA反应结果均为阴性;利用该PCR对鸡胚样品进行检测,核酸阳性率为76%。[结论]该研究初步建立了基于MG脂蛋白基因的特异性PCR检测方法,为MG的临床检测奠定了基础。 相似文献
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为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至105倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。... 相似文献
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猪圆环病毒3型(porcive circovirus type, PCV3)是近年来发现的一种新型病毒,可对猪群造成严重影响。介绍了PCV3病毒及其危害,并阐述了规模化猪场中PCV3病毒检疫方法,包括血清学检测、RT-PCR和测序技术等,提出了有效防控该病毒的建议,以帮助规模化猪场早期发现和及时控制PCV3病毒,减轻其对猪群健康和养殖业发展的影响。 相似文献
9.
根据对虾肝胰腺细小病毒(HPV)保守基因序列,设计特异性的锁式探针及其扩增引物,优化反应条件,建立了肝胰腺细小病毒超分支滚环扩增检测方法。实验中采用一步法连接,探针在Taq DNA连接酶作用下,58℃连接40 min、62℃扩增30 min便可以扩增出明显条带。反应特异性验证实验表明,该体系能够特异性地检测出HPV,而不与供试的其他对虾病原发生交叉反应;灵敏度分析结果显示该方法的检测极限为105 copies/μl,与PCR检测方法相比,一步法连接的滚环扩增的灵敏度低两个数量级。该方法反应过程中温度变化次数少,基本都在等温条件下进行,不需要PCR仪,可发展成为在简便实验条件下使用的简易检测方法。 相似文献
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为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。 相似文献
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《水产学报》2021,(5)
为了建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR扩增,制作标准曲线,建立AngHV的qPCR检测方法,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。结果显示,qPCR的阈值循环数(cycle threshold value, CT)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数(R~2)达到0.999,扩增效率为100.855%;该方法特异性好,可特异性检测AngHV,而对鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus, RGV)和鳗鲡虹彩病毒(Eel iridovirus, EIV)无扩增;该方法重复性强,组内和组间变异系数分别小于1%和2%;该方法灵敏性高于普通PCR法,最低可检测到10个病毒拷贝,而普通PCR法为1 000个病毒拷贝。qPCR检测发现,在感染AngHV的欧洲鳗鲡主要组织内均可检测到AngHV,并且鳃、鳍和皮肤黏液内的病毒量显著高于其他组织;对保存的25份疑似鳗鲡"脱黏败血综合征"病料进行检测,阳性检出率为96%,而普通PCR法的阳性检出率仅为76%。本研究建立的AngHV SYBR GreenⅠqPCR检测方法灵敏性高、特异性强、重复性好,可用于AngHV的快速和定量检测,对鳗鲡"脱黏败血综合征"的防控也具有重要意义。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒Taq Man real-time PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR技术扩增出草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白编码区长度为1 250 bp的片段,克隆到pEGFP-N1载体上,构建重组质粒pEGFP-N1-VP6。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pEGFP-N1-VP6重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了草鱼呼肠孤病毒的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.998 09,斜率为-3.373;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×106 copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出草鱼呼肠孤病毒,而对鲤春病毒血症病毒(SVCV)、传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)无检测信号。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒Taq Man real-time PCR方法灵敏度高、特异性强,可进行定量分析,对草鱼出血病快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。 相似文献
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为了建立美洲鳗鲡腺瘤病毒（American Eel Adomavirus, AEAdoV）的检测方法,根据AEAdoV福建株的superfamily 3 helicases (S3H)序列,设计了二对引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,比较两种方法对AEAdoV-FJ检出率,并对美洲鳗鲡体内各组织的病毒含量进行了分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300bp,利用其构建了qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR的阈值循环数(cycle threshold value,CT)线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067％;采用普通PCR法和qPCR可检测的最低AEAdoV拷贝数分别为100个和10个;上述两种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒（Rana grylio virus,RGV）、鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus,AngHV）、鲤疱疹病毒（Koi herpes virus,KHV）、对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus,WSSV）、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(Japanese Eel Adomavirus,JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(Marbled Eel Adomavirus, MeAdoV)均无扩增反应;qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35 份美洲鳗鲡病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡组织的病毒含量分析结果显示心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾的病毒含量相对较低。上述结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况具有重要意义。 相似文献
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猪圆环病毒病研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
<正>猪圆环病毒(PCV)病是近几年新发现的一种猪的传染病,由猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)引起猪的一种多系统功能障碍性疾病。猪圆环病毒病临床上以新生仔猪先天性脑震颤和断奶仔猪多系统衰竭综合征(postw-eaning multisystemic wastingsyn-drome,PMWS)等为主要特征。该病原体已被确认为圆环病毒(PCV-2),研究表明,Ⅱ型猪圆环病毒(PCV-2)不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的病原,而且能够引起多种猪病,主要有PMWS、猪皮炎及肾病综合征、猪增生性坏死性肺炎、猪呼吸与繁殖障碍综合征、猪细小病毒、传染性先天性震颤等均与PCV-2感染有重要关联。 相似文献
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为建立鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法，根据EeCV复制相关蛋白(replication-associated protein, RAP)基因的保守序列设计特异性引物，并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。qPCR的阈值循环数(Cycle threshold value,Ct值)与标准品的拷贝数线性关系良好，且线性范围广(1.0×108～102拷贝数/μL);可特异性检测EeCV,而对鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus)、猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)无扩增；重复性强，组内和组间变异系数均小于3%;灵敏性高于普通PCR法10倍。且qPCR检测后发现，在感染EeCV的鳗鲡体内重要器官均可检测到EeCV,其中鳃的病毒量显著高于其他组织；对保存的44份疑似鳗鲡病毒性感染病料进行检测，阳性检出率为98%,而普通PCR法的阳性检出率为73%。 相似文献
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鲤疱疹病毒2型和3型主要感染鲫(金)鱼(Carassius auratus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)和锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)及其杂交种,具有高度的传染性和致病性,对养殖鲤科鱼类危害严重。为了建立快捷、高效且能同时检测这2种类型鲤疱疹病毒的检测技术,本研究根据鲤疱疹病毒的DNA聚合酶基因(2、3型)、解旋酶基因(2型)和胸苷激酶基因(3型)的保守序列,设计了3对特异性引物,通过对三重PCR的反应条件进行优化,建立起鲤疱疹病毒2型和3型三重PCR检测方法,并运用该方法对实验室保存的鲫鱼和鲤鱼组织样品进行检测。结果显示,该三重PCR检测方法仅在鲤疱疹病毒阳性样品中扩增出3条特异性条带,表现出良好的特异性;以克隆的目的基因质粒为模板,进行10倍梯度稀释,该检测方法能检出的极限值为2.85×102 copies/μL,表现出较高的灵敏性;运用该方法检测122份鲫鱼和60份鲤鱼样品,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)和行业标准(SC/T 7212.1-2011)方法检测的结果一致。本研究表明,构建的三重PCR检测方法不仅具有较高的准确性和灵敏度,还能同时检测2种类型的鲤疱疹病毒,有效提高检测效率。 相似文献
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人们越来越多地在育肥猪的呼吸道疾病中诊断出与猪圆环病毒II型相关的肺炎。很多实验室诊断的呼吸系统综合征(PRDC)病例通常是多种病毒混合感染。在美国,2000年,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)占病例的42%,PCV2占22%,猪流感病毒(SIV)占19%,猪肺炎支原体占22%;我们国家现在的情况与此相似。本文介绍3个临床病例分别是PRRSV和PCV2共感染、PCV2和SIV共感染以及PCV2和猪肺炎支原体共感染。这就是今年国内的主要猪病形势,经常导致严重的临床疾病,唯一的组织学损伤是淋巴组织消退和气道纤维化,在这些损伤中大量的PCV2抗原表明PCV2在PRDC中起到重要的致病作用。去年夏季,江苏、安徽、江西、湖南、湖北、河南、山东等地的部分区域发生了以高热、呼吸困难和全身性出血为主的猪疫情。根据所收集的流行病学资料、实验室检测结果和相关动物实验,初步认为造成本次猪疫情发生的主要病原为多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)以及猪2型圆环病毒(Porcine circovirus-2)感染,即3P综合征(3P Syndrome,以下称3P综合征)。这就是例证。PCV2感染相关的疾病经常与一种或多种病原体共发生。PCV2感染经常在PRDC暴发中出现,可能导致这些病例中损伤的严重性和持续性的原因。PCV2感染相关的损伤能够在急性呼吸系统疾病中发现,并不局限于消瘦症状。 相似文献
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为了检测上海市某鲤鱼养殖场的疑似患病鲤鱼是否携带鲤春病毒血症病毒(SVCV),采用鲤鱼表皮瘤细胞系(EPC)进行病毒分离和分子PCR方法对SVCV的糖蛋白基因保守区域进行扩增。试验结果:被病毒感染的EPC细胞呈现细胞圆缩、颗粒增多、大量脱落等病变特征,且该株病毒毒力较强,其病毒滴度TCID50/0.1 mL为105.76。分子方法扩增出714 bp和606 bp的SVCV的保守片段。试验采用细胞培养技术和分子PCR方法检测样品是否携带病毒性病原,建立了一种较为简捷高效的检测方法。该方法适合在短时间内完成大量样品的病原学诊断及检疫任务,具有良好的应用前景。 相似文献
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在已经建立的支气管败血波氏杆菌(Bb)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的优化,成功建立在一个循环条件下同时检测3种细菌的PCR实验室诊断方法。利用一次PCR即可同时扩增出Bb的237bp、Pm的457bp,和HPS的821bp的特异性片段。该方法可检测到1.34×103cfu1/mLBb,1.6×102cfu/mLHPS,2.6×102cfu/mLPm。该方法的敏感性与已报道的各单项PCR方法的敏感性一致。该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。 相似文献
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对虾WSSV和IHHNV多重PCR检测试剂盒的研究与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
在对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)二温式PCR检测技术前期研究的基础上,将这2种病原的特异性引物与PCR基础反应液一起组装成快速检测试剂盒。通过对试剂盒敏感性、稳定性和保存期等技术指标的测定以及对临床样品的检测试验,该试剂盒对同一样品中的WSSV和IHHNV DNA模板均能特异性地扩增出2条与实验设计相符的593 bp(WSSV)和356 bp(IHHNV)的DNA片段,而对其它对虾病原的扩增结果均为阴性;该试剂盒最低能检测到102pg的WSSV DNA和10 pg的IHHNV DNA。对WSSV和IHHNV DNA的检出量分别为102~103pg和10~102pg。 相似文献