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为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。 相似文献
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大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统的结构类型及CRISPR/Cas9系统作用机理,介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状,并针对Cas9和sgRNA的表达、遗传转化策略、靶位点选择等影响编辑效率的关键问题进行了分析讨论,旨在为该技术在大型真菌研究中的应用提供参考。 相似文献
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以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统是近年来迅速发展起来的一种新型基因编辑技术,作为一种高效的育种研究技术已在多种植物中实现了定点突变,具有广阔的应用前景。园林植物观赏性状的改良对丰富园林景观具有重要的作用,但是园林植物的遗传背景复杂,严重制约了基因编辑技术的应用。该文介绍了CRISPR/Cas9系统的基本原理及在植物中的研究进展,总结了CRISPR/Cas9系统针对不同类型植物适合的筛选方法及目前存在的问题,并展望了该技术在园林植物育种中的发展前景,以期能够高效利用CRISPR/Cas9系统改良无基因组参考的植物,快速获得观赏价值高的新品种。 相似文献
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西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。 相似文献
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选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。 相似文献
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通过CRISPR/Cas9技术敲除SRK基因或者SP11基因可以直接将甘蓝类蔬菜自交不亲和材料改造成自交亲和材料。本研究中根据全基因组重测序获得青花菜(Brassica oleracea var.italic) BoSP11基因序列,构建双靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法对BoSP11进行敲除。结果显示,获得的29株转基因植株中有23株发生基因突变,编辑效率为79.3%。TA克隆测序结果表明有4株为纯合突变,19株为杂合突变。统计纯合突变T0代自交结籽情况发现花期自交亲和指数高达6.82,为目前所报道的能获得的亲和性最高指数。T1代植株在隔离大棚中通过蜜蜂授粉平均单株采收种子24.8 g,完全实现不需要人工干预完成亲本材料的自交繁育。 相似文献
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对金针菇(Flammulina velutipes)冷诱导相关的组氨酸激酶基因HK1和HK2构建了基因组编辑(CRISPR/Cas9)pgfvs-Cas9-HK1-gRNA和pgfvs-Cas9-HK2-gRNA表达载体,探索了金针菇菌丝体及原生质体对潮霉素的最低敏感浓度,利用PEG介导的方法将表达载体pgfvs-Cas9-HK1/HK2-gRNA转化金针菇原生质体,经潮霉素筛选后的拟转化子再进行PCR鉴定。结果显示:金针菇菌丝体及原生质体对潮霉素的最低敏感浓度均为50μg/mL;经潮霉素筛选后的部分拟转化子成功扩增出Cas9的部分片段,携带有HK1、HK2基因载体的Cas9蛋白基因成功整合到了金针菇的基因组中,两个表达载体转化率分别为24.1%和12.5%。 相似文献
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西瓜作为重要的园艺经济作物,其CRISPR/Cas9基因编辑效率的快速检测方法仍十分匮乏。以愈伤组织再生能力强的野生西瓜种质ZTC为试验材料,针对西瓜ClPDS基因构建CRISPR/Cas9双靶点敲除载体,利用农杆菌侵染西瓜幼嫩子叶,在含1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸生长素的MS培养基中诱导愈伤组织形成,通过绿色荧光蛋白标记筛选阳性愈伤组织,检测其编辑效率。结果表明,2个靶点均发生基因编辑,靶点1处的编辑效率为42.95%,靶点2处的编辑效率为29.92%。在愈伤组织中建立了西瓜生长发育早期有效基因编辑效率检测体系,为后续编辑株系的确定节约了大量时间,为基因编辑技术应用于西瓜重要农艺性状改良及优异种质创制提供了技术支撑。 相似文献
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为了构建番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系，用SlU6-2p、SlU6-3p、SlU6-7p、SlU3-5p、SlU3-9p和SlU6-5p启动子分别替换pKSE401和pCBC-DT1T2载体中的拟南芥U6启动子，构建了1个双元载体（p MGET）、2个中间载体（pKC-S2M和pKC-S3M）和3个gRNA模块载体（pCBC-S1、pCBC-S2和pCBC-S3）。为了测试该多基因编辑体系，通过PCR扩增、Goldengate克隆和同尾酶技术，将含有6个番茄果实性状相关基因Green flesh(GF)、Ovate(O)、Locule number(LC)、SlMYB12(Y)、Tangerine(T)、Uniformripening(U)靶点序列的sgRNA聚合构建多基因编辑载体pMGET-OYGTULC和pMGET-TULCOYG，检测6个基因同时被编辑的效率分别为44.00%和11.76%。用携带pMGET-OYGTULC载体的根癌农杆菌转化番茄材料获得2株6个基因均被编辑的植株，序列变异为单个碱基的插入、单个或多个碱基的缺失及大片段的缺失等多种形式。本研究中该多... 相似文献
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木本果树遗传转化研究进展 总被引：13，自引：6，他引：13
从遗传转化方法和影响遗传转化的因素两方面综述了木本果树遗传转化技术近年来的进展。木本果树遗传转化方法主要有农杆菌介导法和基因枪法;影响转化的因素主要从受体与再生系统、选择标记基因与转化细胞的筛选、培养方法与培养条件等方面进行论述。文章还归纳了导入目的基因并获得再生植株的木本果树种类,并对木本果树基因工程进展及展望进行了讨论。 相似文献
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来自巴西和爱尔兰的研究人员称,他们正在使用CRISPR/Cas9基因编辑技术制造辣味番茄,这些番茄可以用来制作辣椒喷雾、麻醉剂和减肥药等。巴西维索萨联邦大学的阿古斯丁·泽斯哥恩和他的团队在近期出版的《植物科学趋势》中表示,像CRISPR/Cas9这样的基因编辑技术可以“唤醒”番茄中休眠的辣味基因。他们在努力进行制造辣味番茄的工作,希望在2019年年底之前有一些好消息。 相似文献
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基于NCBI数据库提供的番茄八氢番茄红素合成酶基因(PSY 1)全长,并根据基因序列中PAM(proto adjacent motif)的位置设计特异性sg RNA,构建CRISPR/Cas9 Level 1、Level 2载体;将设计好的载体转化农杆菌,继而转染番茄子叶,利用PCR产物测序法检测sg RNA在番茄基因组中的敲除效率。结果表明,36个转基因植株中有22个PSY 1基因目标区出现不同数目的碱基缺失、增加或互换,初步估计基因敲除效率为61%。本试验在番茄中初步建立了CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除。 相似文献
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以大果型栽培番茄资源“T048”为材料,利用CRISPR/Cas9技术对滞绿基因SlSGR1进行定向编辑。对19株转基因阳性株系进行靶位点序列分析发现,共有10株发生了编辑事件,编辑效率为52.6%。通过测序分析发现,编辑类型涉及碱基的缺失、插入及替换,多数发生在PAM序列上游3～4 bp碱基处,同时也发现了两个编辑位点间共565 bp的序列倒位。表型分析发现,T1代纯合编辑株系叶片衰老减缓,果实表现为铁锈色,且番茄红素、叶绿素及β–胡萝卜素含量显著提高。对类胡萝卜素合成关键基因进行分析发现,纯合编辑株系果实中的SGR1表达量显著降低,而PSY1表达量显著提高。结果表明,通过CRISPR/Cas9技术对滞绿基因SlSGR1进行定向编辑可有效提升番茄果实中番茄红素、β–胡萝卜素等类胡萝卜素含量,进而为番茄营养品质育种提供新种质。 相似文献
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利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2（Enhanced disease resistance 2）,在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1,构建CRISPR/Cas9敲除载体,通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序,结果表明,共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变,编辑效率为32%;突变体植株生长势较弱,叶片较小,茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测,结果表明,接种葡萄白粉菌（Erysiphe necator Schw.）5 d后,突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝,表皮细胞产生大量明显的H2O2,而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器,无明显H2O2产生。这些结果表明,可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2,提高葡萄白粉菌抗性。 相似文献