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1.
草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ的融合表达、纯化和抗血清制备 总被引：2，自引：0，他引：2
采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-Ⅰ融合蛋白表达质粒pGEX-IGF.质粒转化大肠杆菌BL21菌株.该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白.在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白.经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF.以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-Ⅰ的抗血清.凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1:64,说明表达产物具免疫原性. 相似文献
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采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )cDNA ,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX 4T 1载体中 ,构建草鱼IGF I融合蛋白表达质粒pGEX IGF。质粒转化大肠杆菌BL2 1菌株。该菌株经IPTG诱导可表达分子量约 34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白。经 30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后 ,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF I的抗血清。凝胶双扩散试验显示抗血清效价为 1∶6 4 ,说明表达产物具免疫原性 相似文献
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根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。 相似文献
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凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
精氨酸激酶（arginine kinase,AK）在调节无脊椎动物磷酸精氨酸与ATP之间能量平衡的过程中具有重要作用。在前期工作基础上,设计特异引物,以凡纳滨对虾肌肉组织cDNA为模版,克隆得到了1 071 bp的凡纳滨对虾精氨酸激酶的完整开放阅读框;将它克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化BL21 (DE3) 菌株,经诱导后表达出GST-AK融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗血清,经检测该抗原与抗体识别良好。利用得到的抗体对凡纳滨对虾AK在蛋白质水平上的特异性表达进行分析发现,精氨酸激酶在对虾的肌肉、心脏、神经、血细胞和胃组织中具有高的表达量,而在眼柄、肝胰腺、鳃和皮肤组织中表达量较低。为进一步研究精氨酸激酶在对虾体内的功能奠定了基础。 相似文献
6.
采用PCR方法从鱼源霍乱弧菌Y1株（Vibrio cholerae Y1）扩增毒素共调菌毛蛋白A(toxin-corcgulated pilin A,TcpA)基因并克隆至pMD 18-T载体.序列分析显示tcpA基因ORF长675 bp,编码224个氨基酸(GenBank登录号EU649677).同源性比对发现,该基因与GenBank中登录的7个霍乱弧菌参考株相应基因序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性均很高,分别为99.6％～ 99.7％和98.7％～ 99.1％,表明TcpA蛋白相当保守.将tcpA基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,并进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现分子量约为47.0 kD的重组TcpA融合蛋白主要以包涵体形式表达.Western blot检测结果显示,重组TcpA融合蛋白可与鼠抗Vc Y1菌株菌毛蛋白抗血清发生特异性结合反应.用纯化的重组TcpA融合蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)制备抗血清,双相免疫扩散试验检测抗体效价达1:16,且该抗血清能够明显抑制Vc Y1菌株对HEp-2细胞的黏附.草鱼免疫后第25天用Vc Y1菌株攻毒,结果相对免疫保护率达到73.33％.研究结果表明,组TcpA蛋白仍保留着天然菌毛蛋白的免疫原性、免疫反应性和免疫保护性,重组TcpA蛋白可作为霍乱弧菌的候选诊断抗原和疫苗抗原. 相似文献
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以传染性造血器官坏死病毒Sn1203株(IHNV-Sn1203)基因组RNA提取物为模板,利用生物信息学软件分析,通过RT-PCR一步法扩增截短的G蛋白基因序列(约375 bp),将其克隆到表达载体p ET-27b中,构建重组表达质粒p ET-27b-IHNV-short G,通过大肠杆菌Rosetta表达菌株获得高效表达。在IPTG浓度为0.25 mmol/L时,37℃诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白相对分子质量约为14 000,符合预期大小,并以包涵体的形式表达,4 h时目的蛋白表达量最大。蛋白经变性、复性处理后获得不带任何标签的纯化蛋白,并利用该蛋白制备兔抗血清。ELISA结果显示,兔抗血清的效价为1∶80 000,说明制备的兔抗血清能够识别表达的重组蛋白;间接免疫荧光结果表明兔抗G蛋白血清具有良好的特异性,并且与VHSV参考毒株没有任何交叉反应。 相似文献
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大菱鲆胰岛素样生长因子-I成熟肽的克隆、重组表达及活性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
通过RT-PCR方法从大菱鲆肝组织克隆了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)成熟肽片段,分析表明,此成熟肽由70个氨基酸残基组成,含有3个链内二硫键。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,实现了IGF-I成熟肽和GST蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)plysS中的融合表达。融合蛋白分子量约为34ku,诱导4h时占菌体总蛋白的59%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting免疫印迹表明,融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。包涵体经6mol/L盐酸胍变性溶解及脉冲法稀释复性后,通过GSTrapFF亲和预装柱纯化,获得了电泳分析纯的融合蛋白。以细胞增殖实验检测蛋白生物活性,结果显示,纯化蛋白能促进大菱鲆肾脏细胞的增殖。 相似文献
9.
日本沼虾VASA蛋白的原核表达、抗体制备及其免疫鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85 ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Westernblotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni2+-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160 000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识别融合蛋白,而且也能识别日本沼虾性腺粗提液中的内源性VASA蛋白,免疫组化进一步显示,VASA蛋白主要分布在卵母细胞核周围和精原细胞质中,成熟精子中无信号,暗示VASA在日本沼虾生殖细胞发育分化过程中扮演重要角色。 相似文献
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栉孔扇贝Foxl2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与检测 总被引：1，自引：0，他引：1
以栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵巢cDNA为模板,采用PCR扩增Foxl2(forkhead box l2)基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,筛选鉴定阳性克隆,经测序鉴定后提取质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以IPTG诱导Foxl2蛋白表达,用SDS-PAGE鉴定表达情况,经镍柱纯化表达蛋白,通过免疫新西兰白兔(New Zealand white rabbits)制备多克隆抗体,以ELISA测定抗体效价,最后用WB(Western Blot)检测抗体特异性。结果表明,重组载体转化BL21后经1.0 mmol L~(-1)IPTG于37℃诱导6 h可产生大量Foxl2蛋白,主要以包涵体形式表达。经镍柱柱纯化可得到纯度较高的Foxl2蛋白,浓度达800 ug·mL~(-1)。免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,效价大于1∶128 000。WB检测显示:该抗体能特异识别扇贝卵巢中的Foxl2蛋白,同时发现Foxl2蛋白在卵巢中强表达,而在精巢中几乎不表达,揭示栉孔扇贝中该蛋白具雌性性别相关性。研究成功获得效价高且能特异识别天然Foxl2的多克隆抗体,为后续深入研究Foxl2在栉孔扇贝卵巢中的功能提供了分子工具。 相似文献
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Yu Juhua Chen Xuefeng Li Jianlin Tang Yongkai Li Hongxia Xu Pao Dong Zaijie 《Aquaculture Research》2010,41(11):e743-e750
Molecular marker‐assisted selection increases the selection precision and reduces the number of generations required to achieve a desired improvement. Here, we report on the relationship between polymorphism in the insulin‐like growth factor II (IGF2) gene and growth trait in a genetically improved farmed tilapia strain (GIFT strain). We first isolated the entire IGF2 (5517 bp), including the complete reading frame and three interrupting introns. After sequence comparison of IGF2 from 10 individuals, we identified nine polymorphic sites in intron 1 and intron 3, and four silent mutation sites in exon 2 and exon 3. Four of the 13 polymorphic sites were examined and genotyped using various technologies, including PCR‐RFLP, tetra‐primer PCR and PCR‐PAGE among 192 experimental individuals. Regression analyses demonstrated that two sites, G161A in exon 3 and the microsatellite locus in intron 3, were significantly associated with male GIFT growth. These two putative markers will be further validated in our future breeding project. 相似文献
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基于vhhP2基因的SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物, 建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法。构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品, 进行SYBR Green I实时定量PCR, 在Tm为60℃时, 扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰, 扩增所得标准曲线为y= –3.331x+37.48, 相关系数为0.998, 扩增效率为1, 最低可检测到7个拷贝。实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性, 对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。
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为了建立鲤 IGF2b (insulin-like growth factor 2)基因全基因组信息 SNPs (single nucleotide polymorphism)的获取体系,并验证该获取体系在黄河鲤新品系选育中运用的适用性,本研究首先对 10个不同鲤品种的 33个鲤个体重测序数据进行分析,整体上了解 IGF2b 基因的单核苷酸位点及其在基因组上的分布情况。然后在基因组 DNA 水平上分段获取 IGF2b 基因的 SNPs 信息,并以不同的鲤品种验证引物的适用性,最后在黄河鲤新品系中检测其应用。研究结果:获得 8 对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)引物进行分段克隆的结果,并通过直接测序和限制性片段长度多态性来获取相应的 SNPs。经过直接测序,本文对黄河鲤、建鲤、黄河鲤和建鲤的正反交后代进行 PCR 检测发现条带单一,目地片段正确;结合黄河鲤新品系的体重数据,本文又以 IGF2b3#引物检测到一个与体重明显相关的 SNPs,同时检测到一个与该基因表达量相关的另一个 SNPs。本研究的方法能够在该基因全基因组范围内开展鲤分子育种中 SNPs 的检测,并验证发现黄河鲤新品系 IGF2b3#引物 227 号位点处,出现的突变位点使体重降低,且有一处 SNPs 与其表达量有关。这将为其他物种、其他功能基因的多态性分子标记研究提供思路。 相似文献
14.
分别将Cu~2+,Zn~2+ Co~'+,Ni~2+和Li~+按照等对数间距法设置浓度梯度,测定其对西藏拟溞(Daphniopsis tibetanaSars)的急性毒性,根据各单种金属的48 h EC_50值,按毒性1:1等距离设置浓度梯度测定这些金属离子对西藏拟溞的联合毒性.结果表明,西藏拟溞对这5种金属离子表现出了较高的耐受性,其毒性由强到弱依次为铜、锌、钻、镍、锂,其24 h EC_50分别为12.75 mg/L,18.32 mg/L,83.26 mg/L,196.97 mg/L,386.34 mg/L;48 h EC_50分别为3.27 mg/L,4.96 mg/L,27.49 mg/L,66.09 mg/L和325.42 mg/L.联合毒性实验中,Cu+Zn,Co+Ni,Co+Li,Ni+Li,Co+Ni+Li,Cu+Zn+Li和Cu+Zn+Co+Ni+Li对西藏拟溞的毒性效应为拮抗作用,而Cu+Zn+Li,Cu+Zn+Ni和Cu+Zn+Co+Ni对西藏拟溞表现出先拮抗作用后协同作用的毒性效应.西藏拟搔对金属离子有较高的耐受性,特别是对含有锂的金属离子组合往往表现为拮抗作用的特征,这很可能是西藏拟搔在西藏高锂盐湖中可高密度存活和快速生长的适应性机制.本研究旨在了解西藏拟溞对金属离子的耐受性,探讨其作为金属离子测试生物的可行性,并为大规模培养中培养液条件优化提供理论依据. 相似文献
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以双棘黄姑鱼(Protonibea diacanthus)为实验对象,通过RACE方法克隆得到IGFs家族成员IGF3。双棘黄姑鱼IGF3 c DNA全长1 184 bp。氨基酸一致性分析显示,双棘黄姑鱼IGF3与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)一致性最高,仅为58.0%;与自身IGF1的2个亚型及IGF2相比,一致性分别低至26.2%、25.2%和21.9%。系统进化树显示鱼类IGF3基因先与IGF2聚类,再与IGF1汇聚构成IGF家族,最后IGFs与胰岛素聚类。组织表达模式显示IGF3在双棘黄姑鱼心脏、性腺、脑区均有表达,在性腺中表达最强。实时定量PCR结果表明,IGF3在精巢发育期表达量显著高于其他时期,呈显著下降趋势;在卵巢成熟期的表达量显著高于其他时期。此外,雌鱼在成熟期前、中、后脑IGF3的表达量显著高于其他时期,而雄鱼各脑区IGF3表达趋势呈多样性。上述结果表明,IGF3可能参与了双棘黄姑鱼精巢发育和卵巢成熟期生殖功能的调节,且前脑可能主要参与了IGF3在性腺表达的反馈调节。 相似文献
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将不同浓度Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋液分别灌注罗非鱼嗅觉器官,研究其对ＥＯＧ反应的影响。结果表明,这３种离子对ＥＯＧ反应均呈抑制效应,抑制作用的大小与金属离子的种类及浓度有关,Ｃｄ２＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋有效ＩＣ５０分别为３３．９１、６７．７３、１９１．４４μｇ／Ｌ;毒性顺序为：Ｃｄ２＋＞Ｈｇ２＋＞Ｐｂ２＋。 相似文献
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通过实验室模拟培养的方法,采用6个不同Mn2+浓度(0、10、100、1000、10000、30000nmol/L)的培养处理,对四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)的生物量、叶绿素a含量、培养基中Ca2+、Mg2+离子的含量分别进行了测定。结果表明,不同Mn2+浓度对各指标均有显著影响,其中对叶绿素a含量的影响达极显著(P<0.01);低Mn2+浓度(0~1000nmol/L)促进四尾栅藻细胞生长和叶绿素a的合成,而高浓度Mn2+(30000nmol/L以上)抑制四尾栅藻细胞生长,导致生物量下降;叶绿素a含量显著降低(P<0.05);四尾栅藻细胞吸收的Ca2+、Mg2+与其生物量成正比。在所设置的浓度范围内,Mn2+并未表现出与Ca2+、Mg2+之间明显的拮抗作用。 相似文献
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以单细胞雨生红球藻为试验材料,以MAV为培养基通过单因子试验和正交试验研究了Cu2 、Zn2 、Co2 3种微量元素离子对雨生红球藻生长的影响。单因子试验结果表明,Cu2 、Zn2 、Co2 最佳质量浓度分别为2.0×10-7、3.4×10-7、9.0×10-7mol/L。正交试验结果表明,Cu2 的最适质量浓度是2.0×10-8mol/L;Zn2 的最适质量浓度是3.4×10-7mol/L;Co2 的最适质量浓度是6.0×10-7mol/L.。在这3种重金属离子的正交试验中在所研究的浓度范围内Cu2 和Co2 存在着较显著交互作用。 相似文献
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Two phospholipase A2 (PLA2) isoforms, tentatively denoted as DE-1 and DE-2 PLA2s, were purified from the hepatopancreas of red sea bream (Pagrus major) to near homogeneity by sequential column chromatography on S-Sepharose fast flow, DEAE-Sepharose fast flow and butyl-Cellulofine, and by ion-exchange, gel-filtration and reversed-phase HPLC. The purified DE-1 and DE-2 PLA2s both showed a single band with the apparent molecular mass of approx. 13.5 kDa by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and were found to be both related to group I PLA2 based on the N-terminal amino acid sequences. DE-1 PLA2 had a pH optimum in the alkaline region at around pH 10 and required approximately 10 mM of Ca2+ and 4-10 mM of sodium deoxycholate for its maximal activity, using 2 mM of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine as substrates. DE-2 PLA2 also had a pH optimum in the alkaline region at around pH 8-9 and required >10 mM of Ca2+ and approximately 6 mM of sodium deoxycholate for its maximum activity with 2 mM of phosphatidylcholine as a substrate; its enzymatic activity towards phosphatidylethanolamine was greatly inhibited by the addition of sodium deoxycholate. The results demonstrate that red sea bream hepatopancreas contains two enzymatically distinct group I PLA2 isoforms. 相似文献
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Cu2+、Zn2+和Cd2+对茂名海域文昌鱼酸、碱性磷酸酶的影响 总被引：3，自引：0，他引：3
试验结果表明,在Cu2+质量浓度为0.096 mg/L水体中生活的文昌鱼酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)均不受抑制作用,在Cu2+质量浓度为0.16、0.256、0.356 mg/L水体中生活的文昌鱼的ACP、ALP活性均显著受抑制(P＜0.05),随时间延长和质量浓度升高,抑制作用增强.在Zn2+质量浓度达到0.195 mg/L时,文昌鱼的ALP与对照组同期相比受抑制作用显著(P＜0.05),随质量浓度增加,受抑制作用增强;ACP在Zn2+质量浓度达到0.39 mg/L时,文昌鱼ACP第10 d影响不显著(P＞0.05),第20 d和30 d表现出显著(P＜0.05)抑制作用,超过这一质量浓度,受抑制作用增强.在Cd2+水体中生活的文昌鱼ALP在Cd2+质量浓度为0.4 mg/L时,抑制显著(P＜0.05),在此质量浓度水体中的文昌鱼ACP在第30 d测定时也表现为抑制显著(P＜0.05),随时间延长和质量浓度增加,文昌鱼ACP、ALP活性受抑制作用增强,在最高质量浓度为2.0 mg/L时,至中期已经死亡. 相似文献