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1.
根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7、bac5和防御素（LAP）成熟肽基因序列,人工合成了抗菌肽融合基因Bac7-Bac5-β,克隆到BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFAST HTb载体中,构建了重组转座载体pFASTBac-B7-B5-β,转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,PCR方法筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-B7-B5-B,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞出现病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞,收集Sf9细胞超声破碎,12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见表达的融合蛋白带,分子量大小为20kD,与预测大小相符,表达量约占细胞总蛋白的10.6％。体外抑菌实验表明重组的rB7-B5-B蛋白对大肠杆菌具有抑菌活性,本研究为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。 相似文献
2.
摘要：本实验从质粒pGEM-HA中扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建转移载体pFastBacHT-HA并与E.coliDH10Bac中的Bacmid质粒重组，构建重组转座质粒rBacmid-HA。在脂质体介导下将rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达HA蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot和血细胞吸附实验鉴定重组蛋白。结果显示重组HA蛋白分子量约为66kDa，该蛋白与AIV H5亚型鸡血清发生特异性反应，与H7、H9亚型鸡血清不反应，转染重组杆状病毒后的细胞能吸附鸡的红血球，证明HA基因在sf9昆虫细胞中获得了正确表达，不仅具有型特异性，而且有良好的生物反应性。 相似文献
3.
猪生殖和呼吸综合征病毒中国分离株B13株ORF5基因在杆状病毒系统中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究将PRRSV B13株ORF5基因克隆到杆状病毒转移载体质粒pVL1393中,构建了重组转移载体质粒pVL1393-ORF5.用该重组转移载体质粒与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV-SVI-G)基因组DNA(BaculoGold Linearized Baculovirus DNA)共转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda,sf9)细胞,得到重组病毒AcMNPV-OCC-- ORF5 .在感染了重组病毒的sf9细胞中成功地检测到分子量为25kD的ORF5基因表达产物,其能被猪抗PRRSV B13株多克隆血清特异识别.表明sf9细胞表达了所期望的产物,进而也说明基因片段的正确性.猪抗PRRSV VR-2332株多克隆血清对ORF5基因的表达产物无反应,而猪抗LV株多克隆血清则能特异识别,说明PRRSV中国分离株B13株在抗原性上更接近欧洲亚群分离株LV株的抗原性,进一步证实了PRRSV中国分离株B13株属于欧洲亚群.ORF5基因表达产物与天然蛋白分子量十分接近,说明杆状病毒表达系统能较适当的进行合成蛋白的加工和修饰.本研究的结果为PRRS基因工程疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
4.
人IGF-1基因重组杆状病毒表达载体的构建及在sf9细胞中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
以pcDNA3．1／IGF-1为模板，采用PCR方法对IGF-1基因进行扩增，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切回收含IGF-1基因的DNA片段，与pFastHTA连接，获得重组载体pFast／IGF-1；将其转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH10Bac感受态细胞，经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-IGF-1，PCR鉴定得到单-／GF-1条带。将该病毒载体转染sf9细胞，进行病毒重组，Western-blot检测／GF-1表达，并用MTT法检测促内皮细胞生长活性。结果成功获得了重组病毒，Western-blot检测出现1条约13．0kD的带，MTT法检测IGF-1促细胞生长率为24．4％。 相似文献
5.
摘要：将鸡（Gallus gallus）的γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB的BamHⅠ位点上，构建真核转移载体pMelBacB-ChIFN-γ，经限制性内切酶消化、ChIFN-γ特异引物PCR鉴定和序列测定，证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacB-ChIFN-γ质粒与杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染sf9昆虫细胞，经3轮蓝斑筛选纯化，获得了重组杆状病毒rBaculovirus-ChIFN-γ。提取病毒DNA经ChIFN-γ特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定，证明获得了纯化的重组杆状病毒，命名为rBaculovirus-ChIFN-γ。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞，收获接种后不同时间的细胞进行SDS-PAGE,结果表明ChIFN-γ基因在昆虫细胞中获得了表达，表达的重组蛋白分子量约为19 kD。应用在大肠杆菌(Escherichia coli )原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIFN-γ多克隆抗体进行Western blot分析，表明表达的重组蛋白具有抗原性。 相似文献
6.
为了使猪源抗菌肽Protegrin-1(PG-1)在原核表达载体中获得高效表达,在不改变PG-1氨基酸的基础上,根据大肠杆菌偏好密码子表,替换PG-1部分密码子,设计两段互补的引物,利用搭桥PCR技术扩增完整的PG-1成熟肽基因,重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成抗菌肽PG-1基因融合表达载体pGEX4T-PG-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)plyS中,筛选得到阳性克隆,并用1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE电泳图谱显示在28 kD处有特异性的蛋白条带出现,经Western blot检测表明重组子已经成功地在大肠杆菌中表达了融合蛋白.纯化得到的GST-PG-1用凝血酶切割后,经用亲合层析得到分子量约为2 kD抗菌肽PG-1蛋白1.38 mg/L.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽PG-1具有明显的抑菌效果. 相似文献
7.
抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法. 相似文献
8.
本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖 (G) 蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL株G蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9 细胞中, 分离出2 个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA) 从重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf9 细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL株感染NA 细胞的G蛋白的分子量一致。35 个抗RC HL株G蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞反应, 表明表达的G蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G蛋白主要分布在Sf 9 细胞的膜表面, 形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL株感染的NA 细胞的荧光相同。 相似文献
9.
苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus,CpGV)是防治苹果蠹蛾最重要的生物药剂之一,为探寻苹果CpGV GP37蛋白的增效机制,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将苹果CpGV gp37基因和绿色荧光蛋白基因(egfp)以N端或C端融合的方式插入苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleocapsid NPV,AcMNPV)基因组中,获得重组的杆状病毒质粒(bacmid),转染昆虫细胞Sf9,然后进行Western blot检测。结果显示,检测到GP37和EGFP的融合蛋白(vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP)和非融合蛋白(vAcGP37、vAcEGFP)都得到了高效表达;用激光共聚焦显微镜观察蛋白的亚细胞定位情况,融合GP37的EGFP主要聚集在细胞质中,没有融合GP37的EGFP遍布整个细胞,说明CpGV GP37蛋白定位于细胞质中。本实验研究了CpGV GP37蛋白的真核表达,为该蛋白的后续研究提供了条件;而该蛋白的亚细胞定位研究,不仅为CpGV GP37蛋白增效机制的研究提供了基础资料,同时丰富了杆状病毒GP37蛋白的相关理论。 相似文献
10.
为了在昆虫细胞中表达猪圆环毒病2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)衣壳蛋白,本研究设计合成引物从临床病料中扩增获得猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)山东株衣壳蛋白基因缺失核定位区的序列,并进行序列分析.将该片段克隆到杆状病毒供体载体pFastBac-1上,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10-Bac感受态细胞,获得重组穿梭杆粒,将该杆粒转染到sf9昆虫细胞中,观察重组杆状病毒致细胞病变效应,并采用PCR、间接免疫荧光实验、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot鉴定衣壳蛋白的表达情况.结果表明,扩增获得的猪圆环病毒山东株属于PCV2d亚型,与我国目前使用的商品化疫苗株(PCV2a及PCV2b亚型)在160～180 aa抗原位点有差异.成功构建了重组供体质粒pFastBac l-PCV2d-Cap和重组穿梭杆粒Bacmid-PCV2d-Cap,获得的重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了约24 kD的PCV2d-Cap,该蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清及His标签抗体发生反应,证明具有良好的反应原性.本研究是我国首次采用杆状病毒系统表达PCV2d亚型衣壳蛋白,为制备PCV2d亚单位疫苗以及酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、防范PCV2d亚型流行提供了理论依据. 相似文献
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构建亚非马蜂(Polisteshebraeus)溶血肽基因重组转移载体pBacHT-GFPTPhMT,转化含穿梭载体Bacmid的受体菌Escherichiacoli(DH10Bac)中,得重组穿梭载体Bacmid-GFPTPhM,再用Lipofectin介导其DNA转染粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞系Tn。SDS-PAGE分析表明,感染Bacmid-GFPTPhM的Tn-5B1-4细胞的表达产物在约为34kD处出现特异性条带,表达量约占细胞总蛋白的3%。Westernblot显示表达产物具有良好的免疫活性。感染Bacmid-GFPTPhM的细胞表达时相动态分析进一步表明,与增强型绿色荧光基因融合的亚非马蜂溶血肽基因的重组病毒已在昆虫细胞中进行了成功地表达,感染后72h表达量可达最高水平。 相似文献
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采用PCR方法扩增出苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）几丁质酶基因（chiA）编码区1.6kb全长片段,并将该片段分别克隆至原核表达载体pET30a和杆状病毒Bac to Bac表达系统转移载体pFastBac中,分别在大肠杆菌（E. coli）BL21(DE3)和草地贪夜蛾细胞系Sf-9中进行了表达。SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌和昆虫细胞中均有效表达了60kDa的蛋白。将表达产物饲喂5龄棉铃虫幼虫后取其围食膜,扫描电镜结果显示,围食膜结构遭到破坏形成大量孔洞。生物测定结果表明,以上两种表达产物对Bt和NPV均具有增效作用。以AcMNPV ChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与Bt Cry2Ac蛋白混合饲喂棉铃虫幼虫,增效率分别为33.4％和54.5％,其LT50较对照处理分别缩短了17.8h和20.6h;当AcMNPV ChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与甘蓝夜蛾核型多角体病毒（MbNPV）混合处理棉铃虫幼虫时,其LT50与对照比较分别缩短了16.6h和22.4h。 相似文献
13.
根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物，从重组质粒pMD- ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和中部跨膜区(60 residues)。改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和 ORF5-2。将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析，ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达，表达量分别为12.2%和39%，证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量。经Western blot分析，融合蛋白具有一定的免疫学活性，表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大。 相似文献
14.
根据已报道无脊椎动物嗅觉相关蛋白Gqα的氨基酸序列保守区设计简并引物,以麦长管蚜(Sitobion avenae)有翅成蚜cDNA为模板,结合RT-PCR及RACE技术扩增编码麦长管蚜Gqα蛋白的cDNA序列,其cDNA序列开放阅读框长为 1 062 bp,编码352个氨基酸,预测蛋白分子量为40.8 kD,与GenBank多个物种Gqα cDNA序列及氨基酸序列均有很高相似性(≥82.17%)(GenBank登录号为EF638906),并具有Gα亚基q类蛋白的典型特征。利用TOPO及Gateway技术,通过体外重组反应,构建苜蓿丫纹夜蛾核型多角体杆状病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)重组病毒。将N端融合了V5-His6标记的V5-His6Gqα序列整合到AcMNPV病毒基因组DNA中, 得到具有独立转染活性的重组杆状病毒。转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)离体细胞系Tn-5B1-4(Tn细胞),进行Gqα蛋白的真核表达。SDS-PAGE检测到预期分子量约42 kD的蛋白带,Western blot检测到表达产物。表明含有6个组氨酸标签及V5抗体结合位点的Gqα融合蛋白V5-His6Gqα在昆虫离体细胞系中成功地表达。 相似文献
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利用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)Bac-to-Bac表达系统在粉蚊夜蛾(Trichoplusiani)TnHi5细胞中表达了GFP与Vip2A(c)酶活成分区域的融合蛋白(GV2融合蛋白),研究了该蛋白对昆虫细胞和病毒产生的影响。Bac-gfpDNA转染48h后部分TnHi5细胞已经检测到荧光,48￣120h出现荧光的细胞数目增加,最后70%左右的细胞都有较强的荧光。而Bac-gv2DNA转染后2￣5d仅有极少TnHi5细胞出现荧光且多呈零散分布,推测这可能是由于杆状病毒极晚期表达的GV2融合蛋白中的Vip2A对细胞骨架成分肌动蛋白进行ADP-核糖基化,从而影响了芽生型病毒粒子(BV)的正常产生或限制了BV在其它细胞间的传播。 相似文献
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本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达,并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体,为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利.通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法,克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子);构建了14种载体:3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED);并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法.使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因;用pKD5-RED、pKD6-GFP和pK)6-RED转化稻瘟病菌后,发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达,Real-time PCR结果证实SOD1启动子指导下的eGFPmRNA表达量是β-tubulin的2.5倍,SOD1启动子指导下的DsRED2mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍,而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍;MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6 -RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近;SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达.这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达,也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究. 相似文献
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师永霞;吕雷;徐炜;袁美妗;庞义 《农业生物技术学报》2006,14(3):401-405
利用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)Bac-to-Bac表达系统在粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni ) TnHi5细胞中表达了GFP与Vip2A(c) 酶活成分区域的融合蛋白(GV2融合蛋白)，研究了该蛋白对昆虫细胞和病毒产生的影响。Bac-gfp DNA转染48 h后部分TnHi5细胞已经检测到荧光，48~120 h出现荧光的细胞数目增加，最后70％左右的细胞都有较强的荧光。而Bac-gv2 DNA转染后2~5 d仅有极少TnHi5细胞出现荧光且多呈零散分布，推测这可能是由于杆状病毒极晚期表达的GV2融合蛋白中的Vip2A对细胞骨架成分肌动蛋白进行ADP-核糖基化，从而影响了芽生型病毒粒子(BV)的正常产生或限制了BV在其它细胞间的传播。 相似文献
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棉铃虫核型多角体病毒（HaSNPV）ORF27编码区全长768bp，编码255个氨基酸残基组成的多肽，预计分子量29.5kD。PCR扩增获得该基因，克隆到融合表达载体pGEX-4t-2中，表达蛋白分子量55.5kD，表达量约占细菌总蛋白的9.2%。割胶透析法纯化融合蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体。再把该基因插入到转移载体pFastBacHTb，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，构建重组病毒；提取病毒基因组DNA，在Lipofectin介导下转染昆虫细胞Tn-5B1-4。表达蛋白分子量为32kD，表达量约占细胞总蛋白的2.9%。将ORF27在昆虫细胞中表达产物固定，免疫电镜法确定表达蛋白主要存在于细胞的细胞质中。ORF27基因表达及在细胞内定位为其进一步研究提供了基础。 相似文献
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斑点叉尾鮰铁调素成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性 总被引：1，自引：0，他引：1
铁调素(hepcidin)是一种在动物肝脏中特异表达的碱性小分子抗菌肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱性密码子人工合成斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)hepcidin成熟肽基因(mCH)。通过PCR方法在mCH的5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点,扩增到的目的片段与表达载体p PIC9K连接构建重组表达载体p PIC9K-mCH后,转化至毕赤酵母GS115细胞;以不同浓度梯度的G418筛选高拷贝转化子,1.0%甲醇、30℃、pH6.0诱导表达72 h,获得重组体mCH。结果显示,斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽区域含25个残基,8个保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端,表明该区域对hepcidin的抗菌活性具有重要作用。Tricine-SDS-PAGE分析显示,分泌表达的重组体mCH的分子量约为3 800D,通过阳离子交换层析获得纯化的mCH。抑菌实验表明,重组体抗菌肽mCH对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)有抑菌活性。本研究首次实现了斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达,为其产业化制备提供了重要的基础资料。 相似文献
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海洋双RNA病毒(Marinebirnavirus,MABV)可引起多种海洋鱼贝的腹水病等病症。利用RT-PCR技术得到了MABVY-6株系A片段的cDNA,进而克隆了病毒的外壳蛋白VP2e的抗原决定簇区642bp片段(vp2e)和另一结构蛋白VP3编码区序列。通过转座作用构建了重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中对VP2e和VP3进行了表达。SDS-PAGE检测和薄层扫描表明,VP2e和VP3与增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)融合蛋白表达量分别占整个昆虫细胞蛋白的15.8%和8.2%。用HisTag单抗和MABV病毒多抗对表达的VP2e融合蛋白进行Westernblot检测,结果表明表达产物具有很好的抗原性。同样,用HisTag单抗和VP3多抗对表达的VP3融合蛋白进行的Westernblot检测,证明融合蛋白表达正确,并且表达产物可溶,易于纯化。实验结果为该病毒结构蛋白和MABV疫苗研究提供了基础。 相似文献