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1.
[目的]将安氏隐孢子虫肌动蛋白基因进行克隆和在Hela细胞中真核表达。[方法]根据筛选安氏隐孢子虫T7噬菌体展示文库获得的肌动蛋白(CA42)部分编码基因序列设计特异性引物,扩增目的基因CA42,构建重组真核表达载体pVAX1-CA42,将其转化入Hela细胞,用间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blotting检测CA42蛋白在转染细胞中的表达情况。[结果]重组质粒能在Hela细胞中表达,且表达产物具有反应原性。[结论]成功克隆并表达了安氏隐孢子虫肌动蛋白基因,并在Hela细胞中能够稳定表达。 相似文献
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[目的]验证安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白(COWP)的免疫原性,为建立安氏隐孢子虫病免疫学诊断方法奠定基础.[方法]根据GenBank已公布的安氏隐孢子虫COWP同源基因序列(DQ060431)设计引物,克隆COWP基因并构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用蛋白印迹法检测其免疫原性.[结果]扩增获得的COWP基因片段为549bp,其序列与GenBank已公布CO WP同源基因序列(DQ060431)的同源性达100％,将其插入pET-32a载体可构建pET-32a-COWP表达载体.重组菌在30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导5h后,其表达形式以可溶性表达为主;NTA-Ni亲和层析柱层析时用200 mmol/L咪唑洗脱液洗脱,即能得到纯化的重组蛋白,重组蛋白分子量约40 kDa.以抗His标签鼠单克隆抗体或鼠抗安氏隐孢子虫高免血清为一抗进行Western blotting检测,均能获得预期的目的条带.[结论]重组COWP蛋白具有良好的免疫原性,可作为安氏隐孢子虫病免疫学诊断的候选抗原. 相似文献
3.
[目的]建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑.[方法]根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性.[结果]基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上.敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%.[结论]安氏隐孢子虫ITS-i基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析. 相似文献
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[目的]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆与序列分析。[方法]从细胞培养的吉林株虫体中提取犬新孢子虫DNA,根据已发表的犬新孢子虫鲥G1基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,采用PCR技术,扩增大新孢子虫SAG1基因片段,并成功克隆到pMD18-T simple载体上,对经PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列分析。[结果]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆后,获得阳性重组质粒。克隆的SAG1基因片段长780bp,编码260个氨基酸,与已发表的美国株犬新孢子虫SAG1基因核苷酸序列（AF132217）的同源性为99．0％,氨基酸序列同源性为98．8％。通过分子生物学软件对翻译水平进行预测,发现吉林株核苷酸序列并不影响氨基酸翻译与蛋白质的表达。[结论]该试验成功克隆重组质粒,为建立犬新孢子虫的高效表达系统奠定了基础。 相似文献
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[目的]构建微小隐孢子虫的miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAXⅠ载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能奠定了基础。 相似文献
6.
[目的]构建微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAX1载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功地构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能打下了基础。 相似文献
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[目的]为了解牛源犬新孢子虫IMP1基因生物学特性,分析牛源犬新孢子虫IMP1基因的克隆与序列。[方法]应用PCR技术扩增IMP1基因,将纯化的PCR产物和pMD18-T Simple Vector连接,构建pMD18-IMP1重组克隆质粒,进行PCR鉴定和酶切鉴定,将鉴定为阳性的质粒进行测序分析。[结果]PCR扩增犬新孢子虫IMP1基因大小为762 bp,克隆质粒经测序分析与GenBank（XM003879531.1）中IMP1基因的同源性为99.9%。[结论]该试验为犬新孢子虫IMP1基因的表达及后续研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。 相似文献
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[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。 相似文献
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[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究. 相似文献
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[目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个（GGGGS）3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。 相似文献
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[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。 相似文献
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[目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体,并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术,从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因,克隆到真核表达载体pc DNA3.0-Flag上,并转染He La细胞,通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示,EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在He La细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pc DNA3.0-Flag-3C,为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。 相似文献
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[目的]构建含人雌激素相关受体α配体结合域区段的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]用Trizol试剂提取人肺腺癌A549细胞总RNA,逆转录为cDNA;应用PCR扩增人EERα-LBD基因片段,插入表达载体pET-30a-c(+)中;转化大肠杆菌BL2 l(DE3)PLysS,经IPTG诱导后表达并鉴定。[结果]应用PCR方法扩增出约687 bp的基因片段,酶切、纯化、连接至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约32 kD,纯化后用生物大分子相互作用系统鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人EERα-LBD融合蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。 相似文献
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[目的]构建水稻OsVDAC5的真核表达载体,对其进行真核表达研究。[方法]将Osvdac5基因与酵母表达载体pPIC3.5K连接,通过电转化的方法插入到毕氏酵母GS115中,筛选阳性重组菌株,通过0.5%的甲醇诱导使外源的水稻Osvdac5基因表达,并利用West-ern Blot鉴定表达蛋白的特异性。[结果]成功构建了Osvdac5::pPIC3.5K酵母表达载体,将其整合到酵母GS115基因组后,对其进行诱导表达,产物经Western Blot检测,证实了表达蛋白为OsVDAC5。[结论]该研究结果为进一步研究OsVDAC5蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
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[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD-NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85b DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。 相似文献