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1.
尝试利用鸟枪反义基因沉默策略构建水稻突变体库．利用水稻反义cDNA文库转化粳稻品种中花11,获得了来源于105块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织的1486个转化植株．随机选择来源于11个独立转化系的335个T0植株进行Hm离体叶片筛选,结果表明所有植株均呈抗性,并且与PER检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假转化体．Southern blot分析结果表明T0植株大部分为单位点整合．T0及T1代转化植株均呈现了一些形态变异,如矮化、无分蘖或多分蘖、结实率降低、粒型或穗型改变、小穗结构改变等．利用Hm离体叶片筛选法对部分T1群体进行筛选,得到了1个变异性状与Hm抗性共分离的突变体,该突变体的变异表型为结实率比非转化对照下降约50％,每穗颖花总数比对照减少约40％,二者的总效应导致突变体单穗产量比对照约下降70％． 相似文献
2.
《南京农业大学学报》2016,(1)
[目的]为了进一步研究黄瓜基因的功能,本文构建了黄瓜T-DNA插入突变体库。[方法]以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,将T-DNA插入突变载体pROK2后转化黄瓜;通过筛选压力梯度试验,确定遗传转化体系最适合的卡那霉素(Kan)筛选浓度;使用PCR检测和斑点杂交方法鉴定T0和T1代转化植株;以‘长春密刺’植株为对照,统计T1代植株表型。[结果]确定100 mg·L-1为最适合的Kan抗性芽筛选浓度。T0代植株PCR检测结果初步证明,pROK2成功整合到14S1和14S2两个T0代株系基因组中。14S1自交后获得55个T1代单株,对其进行PCR检测,发现其中12个单株均扩增出了35S和NPT-Ⅱ片段。以Dig标记的35S和NPT-Ⅱ为探针,对这12个单株及随机从剩余T1代中选取的11个单株进行斑点杂交检测,得到了2个含有35S和NPT-Ⅱ杂交信号的单株:14S1-27和14S1-34。性状调查统计显示:T1代植株在生长各阶段相对于野生型无明显突变表型。[结论]pROK2重组质粒成功整合到了14S1株系的基因组中。对14S1自交后代的PCR检测和斑点杂交检测结果进一步证明了14S1为转化植株,确定14S1为插入突变体。结合T-DNA插入位点鉴定技术可进一步开展相关基因分离及功能研究工作。 相似文献
3.
[目的]构建激活标签载体并将其转入甜瓜中,获得甜瓜T-DNA插入突变体,为甜瓜功能基因组学的研究奠定基础.[方法]用PCR法扩增目的DNA片段,经EcoRI和SacI顺序酶切,将目的片段连接到pCAMBIA2301载体上,构建含4 ×35s Enhancer DNA片段的激活标签载体.以甜瓜品种‘伽师’为材料,利用农杆菌介导的转化体系转化甜瓜愈伤组织,获得甜瓜T-DNA插入突变体.[结果]获得4株T0代甜瓜转化幼苗,通过Kan筛选和PCR鉴定甜瓜转化幼苗的DNA中是否含有目的基因,证明其中3株甜瓜转化幼苗为转基因植株.[结论]获得了突变植株,为甜瓜重要性状基因发掘奠定基础. 相似文献
4.
《河南农业大学学报》2015,(6)
利用分生孢子蘸根法筛选棉花黄萎病菌T-DNA插入转化体库,获得了1个致病力减弱的突变体V546,该突变体在PDA平板上不产生微菌核。利用hi TAIL-PCR技术,获得了突变体V546 T-DNA插入的侧端序列。序列比对分析表明,该突变体T-DNA插入位点在大丽轮枝菌基因VDAG_07282.1的编码区。 相似文献
5.
在水稻T-DNA插入突变体库中发现一个生长缓慢的突变体Osdg,其T-DNA插入位点侧翼序列编码一个WRKY类转录因子(OsWRKY10)。为了明确插入位点的基因是否为引起突变表型的基因,构建了抑制OsWRKY10基因表达的dsRNA干涉载体并转化水稻(Oryza sativa L.subsp.japonica,中花11),获得转基因植株(WInW)。T1代转基因植株的表型观测结果表明,部分WInW干涉植株出现生育期延长、株高下降、分蘖数减少、穗长缩短等表型,与突变体Osdg的突变表型相似,这说明,抑制OsWRKY10基因的表达可能延缓水稻的生长发育,该基因与引起Osdg突变表型的基因具有相似功能。 相似文献
6.
以优质高产的油菜品种1244W6为材料,采用浸花蕾方法,将含有激活标记和Basta筛选标记质粒pSKI015的农杆菌进行转化,成功构建了油菜激活标记突变体库.通过Basta筛选,结果共获得约30 000个转基因株系(T1代).将部分转基因株系种子(T2代)培养在不含任何激素、或含有不同浓度植物激素的营养液中,结果筛选出激素反应突变体63个,长下胚轴和短下胚轴突变体分别为15和13个.采用TAIL-PCR技术,克隆了W1016激素反应突变体T-DNA插入位点基因组旁邻序列. 相似文献
7.
一个显性矮秆水稻突变体的获得及其遗传分析 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】分析该研究组已发现的一个显性矮秆水稻突变体的遗传组成及背景。【方法】利用农杆菌介导法转化粳稻品种武香粳9号,产生T-DNA插入群体。在筛选和鉴定水稻T-DNA插入突变体的过程中,发现一个矮秆突变体。利用PCR扩增、Southern杂交等分子生物学方法对该突变体后代进行鉴定及遗传分析。【结果】突变体自交后代群体中出现矮秆和正常株高两种类型,分离比为3﹕1,符合一对显性单基因的遗传,并且矮秆性状的表现与T-DNA插入共分离。利用籼稻品种龙特甫与其纯合矮秆植株进行杂交,杂交F2代的矮秆株与正常株的比例同样呈3:1分离,符合一对显性单基因的遗传规律。利用SSR等分子标记,将该基因定位在水稻的第4染色体上。【结论】该矮秆性状由一对显性基因控制,由T-DNA插入引起,位于水稻第4染色体上,可作为进一步分离该基因的遗传材料。 相似文献
8.
观察了农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株RoseBc-3的影响因素,并对遗传转化的有效性进行评估.结果表明:农杆菌与灰葡萄孢共培养的温度和灰葡萄孢分生孢子浓度均能影响转化效率,当共培养温度为22℃、灰葡萄孢分生孢子浓度为1×105个/mL时,转化效率最高,平均每平皿(直径9 cm)转化子数量超过100个;通过特异性引物介导的PCR和特异性探针杂交方法,证明所获得的转化子是农杆菌中T-DNA插入造成的,且大多数(87.5％)T-DNA插入为单拷贝插入;从灰葡萄孢T-DNA插入体库筛选获得了6类突变体,即产孢显著减少或不产孢突变体(占3.8％)、菌丝生长速率减慢突变体(占3.5％)、菌丝稀疏突变体(占1.6％)、菌落颜色异常突变体(占5.7％)、致病力丧失突变体(占3.3％)和致病力增强突变体(占3.0％).采用反向PCR技术和hi-TAIL PCR技术从14个灰葡萄孢突变体菌株中获得了T-DNA侧翼序列,且发现T-DNA在基因编码区和非编码区插入的频率是相同的. 相似文献
9.
[目的]对1个水稻生物产量突变体进行遗传分析。[方法]对转Bar基因水稻后代的筛选和鉴定的过程中,在T1代群体10个株系中发现1个生物产量突变株系;采用除草剂Basta喷洒及PCR扩增等方法对该株系进行遗传分析并进行农艺性状考察。[结果]该基因突变除了使株型增高外,径秆也较粗,开花较早,分蘖多,穗大,生物产量高。该株系分离比率为3∶1,符合孟德尔遗传分离规律。PCR分子检测证实,突变性状与T-DNA插入的目的基因(Bar)没有共分离,表明突变体不是由目的基因的T-DNA插入所引起的。[结论]该研究有助于克隆该突变体诱发基因及理解其对生物产量影响机制。 相似文献
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为探明灰葡萄孢细胞壁相关基因功能,用荧光增白剂Calcofluor White（CFW）从灰葡萄孢T-DNA插入突变体库中筛选细胞壁完整性缺陷突变株,发现一株突变株D-59对CFW的敏感性与野生型相比提高了2.8倍。通过TAIL-PCR扩增突变株的T-DNA插入位点的侧翼序列并对其进行序列分析表明,T-DNA插入于突变株BC1G00770.1基因的外显子部位。RT-PCR的结果显示,D-59的BC1G00770.1基因不表达。突变株D-59的表型分析表明,突变株的菌丝稀疏,菌落呈土黄色,产孢量明显下降,孢子萌发异常,致病能力减弱,细胞壁的几丁质含量下降了48%。 相似文献
12.
Genetic Analysis of a Biomass Mutant in Oryza sativa 总被引：2，自引：0，他引：2
[Objective] The study aimed to reveal the genetic model of a biomass mutant in Oryza sativa. [Method] ln the process of seresning and iden-tification of Bar-transgenic rice, a biomass mutant was found in 10 lines of TI progenies. The mutant was investigated for genetic analysis and agronomic traits by herbicide spraying and PCR amplification. [Result] The segregation ratio is consistent with mendelian law(3:1). The mutant assumed not only higher plant height, wider straw and earlier florescence, but also more tillers, bigger spikes and resuhantly higher biomass. PCR detections indicated that no co-segregation was observed between mutant traits and target gene(Bar) in the T-DNA inserted, proving that the mutant is not caused by the insertion of T-DNA containing target gene (Bar). [Conclusion] Our study may avail to understand the cloning of mutant gene and the mechanism of the mutant gene on biomass. 相似文献
13.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2008,(2)
[Objective] The study aimed to reveal the genetic model of a biomass mutant in Oryza sativa. [Method] In the process of screening and identification of Bar-transgenic rice,a biomass mutant was found in 10 lines of T1 progenies. The mutant was investigated for genetic analysis and agronomic traits by herbicide spraying and PCR amplification. [Result] The segregation ratio is consistent with mendelian law(3∶1). The mutant assumed not only higher plant height,wider straw and earlier florescence,but also more tillers,bigger spikes and resultantly higher biomass. PCR detections indicated that no co-segregation was observed between mutant traits and target gene(Bar) in the T-DNA inserted,proving that the mutant is not caused by the insertion of T-DNA containing target gene (Bar). [Conclusion] Our study may avail to understand the cloning of mutant gene and the mechanism of the mutant gene on biomass. 相似文献
14.
15.
比较了接种病原菌侵染柱花草的几种方法的效果,选定出最佳的初筛和复筛方法,进而对1 230 个转化
子进行筛选,得到致病力缺陷菌23 株,其中致病力减弱的菌株18 株,致病力完全丧失的5 株。利用TAIL-PCR 扩增
致病力丧失突变子t-2430 的T-DNA 插入位点侧翼序列,得到大小为476 bp 的一段序列,BLAST 比对已测序炭疽菌
基因组,发现401nt 和数据库的Contig464的部分序列完全一致,进一步对该段序列的功能进行预测,表明T-DNA 插入
在一预测基因的启动子区域,并且这个预测基因与稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae）的天冬氨酸转氨酶(XP_003719674.1）同
源性为79%。 相似文献
16.
棉花T—DNA标签雄性不育突变体的遗传分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用农杆菌介导T—DNA插入得到棉花雄性不育突变体,与野生型陆地棉（Gossypium hirsutum L）Coker 312杂交得到F1代。F1代植株出现了不育与可育两种性状的分离,分离比是1：1。对F1代进行形态学观察、卡那霉素和除草剂抗性鉴定、PCR扩增检测以及遗传学分析,证实雄性不育突变性状的表现与T—DNA插入共分离,从而认为突变是由T—DNA插入引起的显性杂合突变,这为利用T—DNA标签法进行雄性不育有关基因的克隆奠定了基础。 相似文献
17.
【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。 相似文献
18.
【目的】研究稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）致病力丧失突变菌株B-1015,克隆和分析T-DNA插入位点的侧翼序列,为稻曲病菌的致病机制研究提供参考。【方法】分析稻曲病菌T-DNA插入突变体B-1015菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率以及致病力等生物学表型。用PCR检测T-DNA在B-1015基因组中插入的稳定性,用Southern杂交检测T-DNA插入的拷贝数,用hiTail-PCR扩增T-DNA侧翼序列,用RACE PCR克隆T-DNA标记基因,半定量RT-PCR分析所克隆基因的表达情况。【结果】与野生菌株P1相比,突变菌株B-1015的生长速率和产孢量都有较明显的降低,孢子萌发率无明显差异,致病力丧失。分子检测结果表明T-DNA在B-1015基因组中为稳定的单拷贝插入。hiTail-PCR得到的T-DNA两端侧翼序列在野生型菌株基因组上不相连,RACE PCR在两边的侧翼序列上分别克隆得到Uvt-1015R和Uvt-1015L。预测分析表明Uvt-1015R包含一个长度为948 bp的开放阅读框（open reading frame finder,ORF）,可编码295个氨基酸,5′端非编码区（5′-untranslated regions,5′-UTR）长度为 341 bp,3′端非编码区（3′-untranslated regions,3′-UTR）长度为271 bp。Uvt-1015L包含一个长度为351 bp的ORF,可编码116个氨基酸,5′-UTR为31 bp,3′-UTR长度为174 bp。在已知功能的蛋白中检索,没有发现与Uvt-1015R和Uvt-1015L基因同源的蛋白。序列分析发现T-DNA插入在两个基因序列中间,RT-PCR结果显示,在突变菌株B-1015中,Uvt-1015R表达量下降,Uvt-1015L不表达。【结论】 稻曲病菌突变菌株B-1015致病力等重要生物学表型发生改变,可能是由于T-DNA的插入导致了B-1015基因组重排和Uvt-1015R、Uvt-1015L基因结构的破坏。 相似文献
19.
T-DNA插入产生的水稻小粒突变体的遗传分析(英文) 总被引：4，自引：3，他引：1
[Objective] The aim of this study is to understand the genetic characteristics of a grain shape mutant and its possible role in genetic improvement of grain yield in rice. [Method] On the basis of the collection of T-DNA tag lines, the progeny of homozygous plants carrying T-DNA insertion were screened for mutants with mutated phenotypes. The genetic analysis of the mutant and test for the linkage between the mutated phenotype and the T-DNA insertion were carried out to determine its genetic characteristics. [Result] In the present study, a grain shape mutant induced by T-DNA insertion in rice was identified, which showed small grain. Genetic analysis of the mutant showed that the two types of phenotype, normal and small grain in the segregating populations derived from the T-DNA heterozygotes, fit the ratio of 3∶1. Test for Basta resistance showed that all the mutants were resistant while the normal plants segregated for resistant and susceptible by the ratio of 2∶1. The results indicated that the mutant phenotype cosegregated with Bar gene. The small grain mutant caused by T-DNA insertion was confirmed by PCR amplification aiming at T-DNA. [Conclusion] The grain shape mutant is useful for isolation of the tagged gene and genetic improvement in rice. 相似文献