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克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br# 总被引：1，自引：1，他引：1
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。 相似文献
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《中国农业科学》2010,(21)
【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。 相似文献
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【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。 相似文献
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[目的]克隆大鼠卵巢特异性启动子（OSP-1）片段,并在细胞水平检测该启动子调控标记基因的组织特异性表达。[方法]参考已知大鼠OSP-1序列设计特异性引物,PcR扩增大鼠OSP-1启动子片段并与已公布的大鼠OSP—1序列进行比较。将OSP-1启动子定向克隆到去除CMV的pEGFP—N1载体,构建真核表达载体pOSP—1—EGFP．N1;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下,分别转染水牛的颗粒细胞、乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后12,24和48h在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。【结果lOSP—l启动子扩增片段长480bp,与已公布的大鼠OSP-1序列的相似性达96％;应用启动子预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TA—TAbox和CAATbox的核心启动顺式元件,并含有多个C／EBPbeta转录因子的结合位点;在颗粒细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大,48h荧光细胞数量骤减,且死细胞增多;在乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞均未检测到EGFP基因表达。[结论]大鼠OSP-1启动子控制下的EGFP基因可在水牛颗粒细胞中特异表达,为构建水牛卵巢特并性表达转基因载体奠定了基础。 相似文献
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FADD(Fas-associated death domain protein)存在于Fas/FasL系统中,是信号传导通路的一个信号连接蛋白,FADD通过传递凋亡信号,从而介导细胞凋亡。为进一步验证FADD基因抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将FADD基因连接到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建过表达FADD基因载体,并构建FADD基因的RNAi载体;用脂质体介导法将FADD基因RNAi载体、真核表达载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,观察有无荧光的表达,并使用Real-Time qPCR和Western blot方法检测FADD基因mRNA、蛋白水平的表达情况。结果表明:成功构建出FADD基因RNAi载体和高表达载体,重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染效率可达50%。 相似文献
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采用PCR 技术扩增牛MSTN 基因启子,亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建重组报告载体pGL3-Basic- MSTN-promoter。将重组报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter 与内参质粒pRL-TK 用脂质体法瞬时共转染小鼠成肌细胞系C2C12 和小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1,通过双荧光素酶活性检测其启动子活性遥测序结果表明,成功构建了牛MSTN 基因真核报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter,瞬时转染试验表明,pGL3-Basic-MSTN-promoter在C2C12细胞和3T3-L1 细胞中的启动子活性分别为pGL3-Basic空载体的14.53 倍尧5.02 倍。研究结果为进一步研究MSTN 基因的表达调控机制奠定了基础。 相似文献
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以内蒙古阿尔巴斯白绒山羊基因组为模板，采用PCR方法克隆波形蛋白基因启动子，并与载体pEGFP-N1连接构建启动子荧光表达载体重组质粒，通过转染次级毛囊成纤维细胞，在荧光镜下鉴定启动子活性，应用生物软件对其序列进行信息学分析。结果表明：波形蛋白启动子区含有转录所必需的调控元件TATAbox、CAAT-box、GC-box等以及2个CPG岛；10个与启动子结合的转录因子；荧光镜下转染的成纤维细胞具有荧光蛋白表达，揭示波形蛋白启动子具有活性，它的激活可诱导下游的波形蛋白基因的转录和表达。 相似文献
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目的:构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础,方法:以重组质粒pcDNA3.1/lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-Nl中,形成重组表达载体pEGFP-Nl/lif,并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT-PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达.检测到融合蛋白EGFP-LIF.结论重组pEGFP-N1/lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白,为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础. 相似文献
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人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ,hFIX）cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。 相似文献
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原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
将原核启动子Ptrc和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因从EGFP原核表达质粒pYA3334—EGFP上切下，然后将其插入至真核表达质粒pVAXI真核启动子Pcmv的下游，构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒pVAXD-EGFP，其长度为3823bp。将pVAXD—EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌X4550和转染COS—7细胞，应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS—PAGE测定EGFP原核表达；应用荧光显微镜观察EGFP在COS—7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏茵X4550(pVAXD-EGFP)表达EGFP的量与仅以原核方式表达EGFP的X4550(pYA3334—EGFP)相当；将质料pVAXD-EGFP转染COS—7细胞，EGFP可在COS—7细胞核和胞浆表达，在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明：不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒pVAXD-EGFP，而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平，显示其在新型重组细菌疫苗方面有着诱人的应用前景。 相似文献
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[目的]构建小鼠p300-HAT的真核表达质粒。[方法]利用PCR技术扩增p300的HAT域,然后构建p300的HAT域的真核表达质粒（p300-HAT—EGFP）,并通过PCR验证和酶切验证重组质粒的正确性;提取不舍内毒素的质粒,转染HepG2细胞,通过观测绿色荧光检测转染效率。[结果]PcR产物的电泳结果显示,成功扩增了小鼠p300基因HAT结构域,构建了小鼠p300基因HAT结构域的真核表达质粒,将其命名为m-p300-HAT-pEGFP—C1。重组质粒可以成功表达融合绿色荧光蛋白目的基因蛋白。[结论]p300-HAT—EGFP重组质粒的成功构建为后续开展巨噬细胞NF—kB信号通路的研究奠定了基础。 相似文献
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目的构建并检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）真核表达重组质粒。方法提取肾组织RNA进行逆转录,扩增GPC3基因的编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,酶切鉴定并测序;将克隆成功的质粒转染至Huh7细胞,用荧光定量PCR和Western blot检测GPC3的表达水平。结果成功扩增GPC3编码区,并克隆至载体pcDNA3.1中;GPC3过表达载体转染至Huh7细胞后,荧光定量PCR和Western Blotting检测结果显示GPC3mRNA和蛋白表达水平均明显增加。结论成功构建GPC3过表达载体可用于后续研究。 相似文献
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探索CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对串联型黄色荧光蛋白(YFP)表达的调控作用,将含有串联型YFP、CMV启动子、柔嫩艾美耳球虫组蛋白4(Histone4)上游启动序列和肌动蛋白(Actin)下游调控序列的重组载体pCMV-YFP-YFP、pH4-YFP-YFP-ACT电转染Vero细胞和柔嫩艾美耳球虫子孢子,观察荧光情况.结果证明,CMV启动子不能驱动YFP在柔嫩艾美耳球虫中正常表达,而其自身基因的侧翼序列能够启动和调控串联型YFP在柔嫩艾美耳球虫中的正常表达. 相似文献
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利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础 相似文献
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人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染 总被引：1，自引：0，他引：1
目的：构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．方法：以重组质粒pcDNA3．1／lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP—N1／lif．并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT—PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达．结果：成功构建融合表达载体pEGFP—N1／lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP—LIF．结论重组pEGFP—N1／lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白、为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础． 相似文献