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1.
水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。 相似文献
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转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点分析 总被引：2，自引：0，他引：2
为获得转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点相关信息,本研究应用地高辛标记的NPTII基因片段为探针,与经BamHI酶切的转基因甘蓝型油菜高油酸株系W-4的T2代单株的基因组DNA进行Southern杂交。结果显示:W-4的T2代单株的基因组含有一个T-DNA拷贝。用3到4个根据载体pCNFIRnos序列设计的嵌套特异性引物分别与简并引物组合进行TAIL-PCR反应,扩增得到转基因油菜T-DNA插入位点的左、右边界旁侧序列。经分析右边界旁侧序列长度为470bp,其中180bp为载体序列,290bp为W-4的基因组序列;左边界旁侧序列长度为641bp,其中365bp为W-4的基因组序列,276bp为载体序列。序列比对结果发现该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无其他额外载体序列的整合。blast分析获得的与左右边界相连的油菜基因组序列,未检索到与之高度同源的序列,推测T-DNA插入位点可能位于油菜基因组非编码区。综上所述,本研究分析了转基因油菜W-4基因中T-DNA拷贝数、整合特点和旁侧序列,研究结果为转基因油菜的生物安全性评价以及转基因高油酸油菜的检测提供重要的基础信息。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(11)
利用hi TAIL-PCR方法研究了转基因水稻Bar Kasalath-01中外源基因在基因组上插入位点的序列特征,获得了外源基因T-DNA右边界旁侧序列511 bp,与水稻基因组数据库比对发现,外源基因插入位点位于水稻基因组第8号染色体的第3 326 720处。根据整合位点水稻基因组序列和外源基因T-DNA左边界序列设计引物,扩增得到了左旁侧序列783 bp。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻Bar Kasalath-01的事件特异性定性PCR检测方法,扩增片段分别为783 bp和411 bp。该方法特异性强、灵敏度高,能够在Bar Kasalath-01基因组DNA含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列,还建立了快速鉴定转基因后代植株基因型的3引物PCR检测方法。这些方法的建立,实现了对转基因水稻Bar Kasalath-01转化事件的特异性检测。 相似文献
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外源脱水应答转录因子CBF4基因转化玉米的获得 总被引：8，自引：0，他引：8
用PCR方法克隆了拟南芥脱水应答转录因子CBF4基因,以逆境诱导表达基因rd29A的启动子为驱动,构建了逆境诱导表达载体pBAC146。用基因枪转化法转化玉米优良自交系的幼胚和胚性愈伤组织,轰击后的愈伤组织经过筛选、分化和植株再生过程,共获得36棵转基因植株。经PCR、PCR-Southern和Southern检测表明,外源目的基因已成功整合到部分转基因玉米株系的基因组中。人工干旱处理下,抗旱生理指标测定显示,一个转基因株系的脯氨酸含量和叶绿素含量比野生型对照提高一倍,间接表明转基因株系的抗旱能力在某种程度上有所提高。 相似文献
5.
《分子植物育种》2017,(11)
利用CRISPR-Cas9技术,对水稻稻瘟病感病品种日本晴pi21基因进行定点突变,获得了抗稻瘟病的pi21隐性突变株系。基因编辑载体T0转化植株的检测结果表明,86.7%的T0植株的pi21基因靶序列发生了碱基缺失。通过T-DNA序列的PCR检测,剔除携带T-DNA的T1植株,从23个T1株系筛选获得107个不含T-DNA转基因序列的植株。然后对pi21的编辑位点进行酶切和测序分析,获得了21株pi21纯合突变体。对1个pi21突变株系进行稻瘟病菌孢子喷雾接种,与未转化日本晴相比,突变株系显著抗病。对接种水稻样品的6个病程相关基因进行q RT-PCR分析,与感病日本晴比较,pi21突变株系在接种稻瘟病菌后,病程相关基因诱导表达的速度更快,表达量更高。本研究利用基因编辑技术,实现了对感稻瘟病水稻的定点突变并提高了其稻瘟病抗性水平,为利用该技术培育持久抗稻瘟病水稻品种奠定了研究基础。 相似文献
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水稻OsAPX1基因在烟草中的表达及其抗盐性研究 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究采用RT-PCR方法克隆得到水稻细胞质抗坏血酸过氧化物酶(OsAPX1)基因全长cDNA(基因登录号:D45423);将该基因构建二元植物表达载体pBI121-OsAPX1;用农杆菌EHA105侵染介导烟草叶盘转化法转基因,获得转基因植株,PCR鉴定遗传转化的烟草植株成功地整合了水稻OsAPX1基因;Northern blot鉴定结果表明转基因T1代植株Ta在mRNA转录水平上表达;对Ta株系进行Kana抗性鉴定,表明转基因T2代株系有抗性;对T2代株系做NaCl、NaHCO3、Na2CO3抗盐性鉴定,结果表明与对照相比表现出转基因植株抗(耐)性提高;取T2代植株的叶片在不同浓度H2O2处理下,抗H2O2毒害的能力显著强于对照,转基因植物的抗性有所提高,有望在抗盐碱性育种上应用. 相似文献
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花粉特异性核糖核酸酶基因诱导籼稻雄性不育及其遗传研究 总被引：4，自引：0，他引：4
以水稻愈伤组织和悬浮细胞系作为基因枪转化的外植体,把水稻花粉特异性基因PS1启动子与barnase构成的嵌合基因导入籼稻,获得籼稻五个品种Basmati 1、青油占、胜优2号,明恢63,新山占29的转基因植株.试验以两个质粒PS1- barnase和pILTAB227共转化的方法,以潮霉素B作为筛选因子,选择抗性愈伤及再生植株.获得的barnase转基因植株的育性比未转化的对照明显降低,表现为部分不育和完全不育.除barnase阳性转化株平均株高比对照有所降低外,营养器官发育正常,雌性可育.完全不育的植株花粉粒畸形,不能被I-KI溶液染色,但它们与正常植株杂交能够获得杂交种子.转基因植株的Sonthern杂交分析表明,bamase基因普遍为多拷贝整合.对转基因植株白交及与非转化株测交后代以点杂交分析bamase转基因的遗传行为,发现转基因的遗传符合1～3个插入位点的孟德尔遗传模式. 相似文献
8.
《分子植物育种》2020,(16)
为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。 相似文献
9.
抗玉米丝黑穗病转基因株系的分子检测及抗病株系选育 总被引：1，自引：0，他引：1
采用花粉介导方法将质粒pGL II_RC_1导入玉米自交系海92_1中,获得了T0种子128粒,种子经潮霉素抗性筛选得到抗潮霉素植株16株。对抗性植株分离的统计分析表明,多数情况下几丁质酶基因以单拷贝形式导入转基因植株,后代分离比约为3∶1。抗性苗移栽到大田后,5~6叶期取样进行PCR扩增、PCR Southern blot杂交分析,对T1的分析结果表明,几丁质酶基因已导入转基因植物细胞中。对T2,T3植株的检测结果显示,目的基因已整合到转化植株基因组中并可随植株世代稳定遗传。田间抗病鉴定结果表明,转基因植株及后代的玉米丝黑穗病发病率明显比对照降低。根据分子检测及田间抗病鉴定结果,得到GH05024,GH05028 2个抗丝黑穗病的纯合转基因株系。 相似文献
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转bar基因小麦的抗性遗传及农艺性状分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【研究目的】以皖麦48和扬麦87158两个小麦品种的转bar基因株系为材料,探讨bar基因在转基因小麦自交后代的遗传表现及对农艺性状的影响。【方法】利用涂叶法和PCR法研究bar基因在转基因植株自交后代T1、T2的遗传表现,并对产量及品质等主要农艺性状进行比较分析。【结果】证实抗除草剂bar基因已经整合到小麦基因组中,并能稳定表达;遗传分析显示bar基因能稳定的遗传给后代,符合孟德尔遗传规律;在产量及品质等主要农艺性状方面,转bar基因小麦与对照相比无显著差异。 相似文献
11.
OsHOX4基因是属于水稻植物同源结构域(HD-Zip)转录因子家族的一个成员。本研究利用农杆菌介导法将OsHOX4基因转入籼稻(Oryza sativa ssp.indica)IR64中,获得54株过量表达植株。我们利用southern杂交分析确定了各个株系的拷贝数后,利用TAIL-PCR方法对4个不同的单拷贝株系进行了研究,并在其中找出T-DNA在3个单拷贝株系染色体上的插入位点(分别为染色体5,8,10)。根据T-DNA在各个株系的插入位点分别设计特异性引物,从T1代转基因株系里鉴定出纯合的植株。我们观察到OsHOX4过量表达植株的分蘖数明显高于野生型,株高比野生型明显的变矮,在同一个株系的纯合和杂合的转基因植株表型也有很大的差异。在TAIL-PCR分析基础上,为从T1代转基因作物中鉴定出纯合的植株提供了方法和理论依据。 相似文献
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采用RT-PCR法亚克隆了PDI基因保守区内450 bp的靶标序列作为干扰区段, 构建了含有内含子hpRNA (ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsPDI, 经农杆菌介导转化日本晴, 获得转基因植株; 通过在T0代对其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鉴定, 确定携带有干扰片段的T-DNA区已整合到水稻基因组中, 且在转基因T1代符合3∶1的分离模式。半定量PCR和荧光定量PCR的检测结果表明, PDI基因沉默转基因阳性植株不同器官中的PDI表达量均显著降低, 尤其是其籽粒中表达量较微, 几乎能引起靶基因80%左右沉默。对转基因T2代植株的高温结实特性和籽粒理化品质的检测结果, PDI基因沉默会引起高温胁迫处理下结实率的大幅度降低, 耐热性显著下降, 但其在常温处理下的结实率与对照之间无显著差异。此外, PDI基因沉默后, 稻米的透明度下降、垩白度增加, 但对籽粒粗蛋白总量和直链淀粉含量的影响不甚明显。 相似文献
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利用农杆菌介导法将反义Wx基因导入水稻的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
利用根癌农杆菌将含多基因(hpt选择标记基因、反义Wx基因、GFP和GUS报告基因)的pCAMBIA1304载体导入水稻品种(501R、中花9号和日本晴)的幼胚愈伤组织,分别在含35mg/L、45mg/L和65mg/L潮霉素浓度的筛选培养基上筛选获得抗性愈伤。后经PCR检测,从415株T0代再生植株中选出92株(其中501R、中花9号和日本晴分别为4株、43株和45株)。对这些转基因后代植株进行Southern blotting分析表明：hpt、反义Wx基因已经整合进植物基因组中。绝大多数转基因植株后代的表型正常。成熟种子直链淀粉含量分析表明,部分转基因植株的T1代种子中的直链淀粉含量有不同程度的下降,最低的已下降至6．3％,与对照相比下降了9．8％。 相似文献
14.
将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。 相似文献
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利用根癌农杆菌将含多基因(hyg选择标记基因、反义Wx 基因、PTA基因、GFP和GUS报告基因)的pCAMBIA1304载体导入水稻品种(501R、中花9号和日本晴)的幼胚愈伤组织,分别在含35mg/L、45mg/L和65mg/L潮霉素浓度的筛选培养基上筛选获得抗性愈伤。后经PCR检测,从415株T0代再生植株中选出92株(其中501R、中花9号和日本晴分别为4株、43株和45株)。对这些转基因后代植株进行Southern blotting分析表明：hpt、反义Wx 和 PTA基因已经整合进植物基因组中,绝大多数转基因植株后代的表型正常。成熟种子直链淀粉含量分析表明,部分转基因植株的T1代种子中的直链淀粉含量有部分程度的下降,最低的已下降至6.3%,与对照相比下降了9.8%。 相似文献