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环介导恒温扩增技术（LAMP）及其在植物病毒检测中的应用 总被引：2，自引：1，他引：1
摘要：环介导恒温扩增技术是一种特异、灵敏、简单的新型核酸扩增技术,目前,该技术已经被广泛应用于疾病诊断、食品安全检测及基因芯片等领域。本文综述了环介导恒温扩增法在植物病毒、类病毒检测中的应用,并讨论了其在应用中出现的问题及解决办法。 相似文献
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利用本研究小组克隆的猪IgG Ⅱ类Fc受体cDNA(swFcγRⅡ)基因序列(DQ026064)设计引物,应用RT-PCR技术,从猪外周血白细胞cDNA中扩增了完整的960 bpswFcγRIIORF序列,利用基因重组技术将swFcγRIIORF基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3,经PCR及双酶切鉴定:扩增出901 bp的PCR产物;KpnI/EcoR I双酶切,切出5 376和901bp DNA片段,表明重组质粒pcDNA/swFcγRⅡ构建成功。然后脂质体法转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验鉴定了swFcγRII配体亲和特性。 相似文献
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为丰富福建省猪细环病毒的分子流行病学数据,本研究根据猪细环病毒1a型、1b型和k2型特异性检测引物对临床顽固性腹泻仔猪病料组织进行PCR检测,结果从1例病料中检测到猪细环病毒k2型阳性。并通过设计猪细环病毒k2型ORF2基因特异性引物对阳性病料扩增后进行克隆测序,获得猪细环病毒k2型ORF2基因完整编码区序列。分析发现所克隆的猪细环病毒k2型福建株ORF2基因全长为203 bp,编码有67个氨基酸。本实验株ORF2基因和猪细环病毒k2型代表株德国家猪分离株2p株(Gen Bank登录号AY823991)核苷酸同源性高达97.5%;和猪细环病毒1a型(Sd_TTV31株)和1b型(1p株)代表株核苷酸同源性均低于50.0%,分别为43.9%和47.3%。从遗传进化关系上看,本实验株ORF2基因和Gen Bank中猪细环病毒k2型处于同一遗传进化分支,而猪细环病毒1a型和猪细环病毒1b型均处于其他遗传分支。本研究首次在福建猪群中检测到猪细环病毒k2型感染。 相似文献
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重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是以T4噬菌体的核酸复制机制为基本原理,模仿细胞内的核酸复制机制的一种新兴恒温核酸扩增技术。在多种酶的辅助下,31℃~37℃下恒温20 min即可完成核酸的体外扩增。它具有反应快速、高敏感性、高特异性、低设备依赖性等传统体外核酸扩增技术所不具备的优点。利用RPA技术可以在简易实验设备甚至野外条件下实现对核酸的快速扩增,结合侧流层析试纸技术或荧光检测装置即可对扩增结果进行快速定性或定量检测。但是,RPA技术作为一门新兴技术,在研究方面的应用鲜有提及,尤其在国内。本综述了RPA技术的原理、使用条件、优缺点及其在食品安全检测方面的应用,旨在为该技术今后的深入研究和应用提供一定的参考。 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型PCR检测方法的研究 总被引：5，自引：0，他引：5
【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5ng/ml。 相似文献
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环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase, CAS)在植物甾醇和三萜类物质的合成途径中发挥重要调节作用,研究白芨环阿屯醇合酶BsCAS的序列信息,为进一步研究环阿屯醇合酶的功能奠定基础。基于白芨转录组数据,利用RT-PCR技术扩增BsCAS基因的CDS全长,通过生物信息学软件分析BsCAS蛋白的理化性质和结构特征,并进行氨基酸多序列比对分析与系统进化树分析。结果表明扩增获得的Bs CAS基因CDS全长为2 277 bp,编码758个氨基酸。BsCAS蛋白是无跨膜结构无信号肽的亲水性蛋白,BsCAS蛋白具典型的DCTAE结构域和QW结构域,属于氧化鲨烯环化酶超基因家族成员。BsCAS与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的CAS蛋白具有很高的同源性,亲缘关系最近,并聚为一支。对白芨Bs CAS基因的克隆和序列特征分析为进一步阐明BsCAS基因在调控植物甾醇类物质合成途径中的功能提供数据支持。 相似文献
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为了构建合作猪HMOX1基因过表达载体,并分析其组织表达特征,本研究通过PCR扩增获取合作猪HMOX1基因完整CDS区序列,将其插入到pcDNA3.1(+)过表达载体中,构建pcDNA3.1-HMOX1过表达载体;并通过实时荧光定量PCR检测HMOX1基因在合作猪心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠和背最长肌中的表达情况。结果显示,成功扩增出合作猪HMOX1基因924 bp的完整CDS区,通过双酶切和测序鉴定,HMOX1基因成功连接到pcDNA3.1(+)过表达载体中。组织表达结果显示,HMOX1基因在合作猪组织中表达量最高是脾脏,显著高于其它组织(P<0.05),其次是肝脏、肺脏、肾脏和心脏,在十二指肠中的表达量最低。研究结果为进一步研究HMOX1基因在合作猪高海拔低氧适应过程中的功能提供了重要参考。 相似文献
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【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。 相似文献
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本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。 相似文献
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LAMP检测无乳链球菌方法的建立及应用 总被引：4，自引：1，他引：3
以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作.结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当.所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测. 相似文献
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马铃薯A病毒(potatovirusA,PVA)是一种侵染马铃薯的病毒,严重影响马铃薯的经济价值和产量,为有效防止该有害生物的传入和扩散,建立马铃薯A病毒RT-LAMP检测方法,根据PVA的外壳蛋白基因序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过实验成功建立了PVA的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,36min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯V病毒(PVV)、马铃薯Y病毒(PVY)以及同属的百合斑驳病毒(LMoV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度高10倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应直接进行结果判断。该方法适用于现场PVA的快速检测。 相似文献
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为建立一种能快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的方法,根据GenBank中IBV的基因保守序列,设计一套环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立了IBV RT-LAMP可视化检测方法;该法对IBV RNA最小检测限为10 fg,而常规RT-PCR为1 pg,灵敏度高于常规PCR法100倍;对其他常见鸡病原体检测结果均为阴性;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;本研究建立的IBV RT-LAMP方法简便、快捷、特异、灵敏,且只需1个可控温的水浴锅在1 h内即可完成全部反应,更适合基层业务部门及养殖场的检测,为IBV感染的快速检测提供新方法。 相似文献
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在打击肉制品掺假走私、维护市场秩序、保护野生动物资源等方面,对动物源性成分鉴定技术的特异性、灵敏性、重复性提出了很高的要求。本文阐述了动物源性成分的检测鉴定技术,有多样性和局限性的特点。归纳了重组酶聚合酶恒等温扩增技术原理与应用,解决了PCR技术在仪器上的局限性,优化了早期恒温扩增技术的缺点。指出重组酶聚合酶恒等温扩增技术为动物源性成分的快速准确鉴定提供了坚实的技术基础,并在动物疫病诊断方面也有很好的应用前景。 相似文献
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该研究旨在建立一种快速检测猪多杀性巴氏杆菌的LAMP方法。根据GenBank中猪多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因(ompH)序列,在其保守区域设计了多套LAMP引物,通过LAMP反应,评价其特异性和敏感性,并加入SYBR Green Ⅰ,对其进行肉眼判定。结果显示：建立的LAMP方法在56℃水浴中1 h可对猪多杀性巴氏杆菌核酸进行高效扩增,在反应结束后加入SYBR Green Ⅰ可肉眼进行判断;该方法具有很强的特异性,对其它相关猪病病原菌检测结果均为阴性;其DNA核酸的检测量为0.05pg,是PCR的100倍,显示出很高的敏感性;用建立的LAMP方法对5株猪多杀性巴氏杆菌阳性样品进行检测,结果表明LAMP法与PCR检测的结果是一致的。结果表明该研究建立了一种操作简便、快速、敏感、特异的可对猪多杀性巴氏杆菌进行快速检测并可肉眼判定结果的可视化LAMP方法,适合在基层使用。 相似文献
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Yukie Shiobara Mioko Yoshino Atsuko Uragami Ani Widiastuti Akifumi Omori Keiko Kuba Harufumi Saito Yukimasa Hirata Takahiro Sonoda Takeharu Koizumi Tatsuo Sato 《Euphytica》2011,177(1):91-97
Asparagus (Asparagus officinalis L.) is a dioecious plant. In general, male and female plants are used for open-field culture and intensive cultivation, respectively. Farmers distinguish between the sexes by observing the form of the flower organs. However, because flowering begins 2?C3 years after planting, the sexes cannot be differentiated at transplantation by using this method, and planting of an all-male population is not possible. In this study, the usefulness of loop-mediated isothermal amplification (LAMP), a simple method of gene amplification, for sex distinction at the DNA level was determined. In addition, the phenotypic differences in seeds and seedlings of male and female plants were investigated for application as a method of early sex distinction. By using the LAMP method, the sex could be correctly identified in 100% of the seedlings, suggesting that this method is effective for sex distinction at the gene level. Principal component analysis was conducted with 11 selected parameters after investigating the seeds and seedlings of both male and female plants. The results revealed that male plants tend to have many stalks or cladophylls and female plants tend to have large plant forms, suggesting that the sexes can be distinguished by the external appearance of the seedlings before planting. LAMP and observation of the seedling phenotypes could be useful methods of sex distinction for increasing the efficiency of asparagus breeding. 相似文献