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PCR检测诊断罗非鱼荧光假单胞菌病技术的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库荧光假单胞菌的16S-23S rDNA基因序列设计一对特异性引物,用PCR对4株鱼荧光假单胞菌进行扩增。特异性结果显示该对引物对4株荧光假单胞菌均扩增出与预期大小相一致的428bp的扩增产物,而对罗非鱼嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、罗非鱼迟缓爱德华氏菌、斑点叉尾鮰钻鱼爱德华氏菌、柱状嗜纤维菌、链球菌、葡萄球菌、河弧菌、大肠杆菌和沙门氏菌等10种病原体的扩增,结果全为阴性。该PCR敏感性结果表明可以检测到1pg的荧光假单胞菌DNA模板。 相似文献
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为了建立快速、敏感的聚合酶链式反应(PCR)诊断斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus的肠败血症技术,作者根据NCBI公布的鮰爱德华氏细菌序列,设计了一对特异性诊断引物CM3/CM4,对鮰爱德华氏细菌特异基因片段进行PCR扩增试验,PCR反应条件的优化以及不同检测材料的比较,同时测试了该方法的特异性和敏感性,并对广西4个市县临床样品进行了检测.结果表明:用该引物可以扩增到与预计大小相符的276 bp鮰爱德华氏菌特异性片段;PCR反应与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、迟缓爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;用该PCR法可以检测出病鱼脑、肝、肾及脾中的病原菌,检测的最低细菌数为12个,且病鱼内脏组织、菌落及菌液均可直接用于该PCR扩增;临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析和生化鉴定结果一致.因此,本试验中所建立的PCR检测方法在斑点叉尾鮰肠败血症的诊断和防治方面具有较好的应用前景. 相似文献
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【目的】建立可同时快速检测斑点叉尾鮰败血症3种病原(嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌)的多重PCR检测方法。【方法】根据嗜水气单胞菌溶血素基因(Hly)、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因(DNaseⅠ)以及鮰爱德华菌溶血活化基因(Eha)的保守序列,设计3对特异性引物,优化并建立斑点叉尾鮰败血症3种主要病原菌的多重PCR方法,对其特异性和灵敏度进行考察,并将其用于临床样品的检测。【结果】建立的多重PCR方法,当Hly基因、DNaseⅠ基因以及Eha基因的引物浓度分别为1.0,1.0和0.5μmol/L,退火温度为59.5℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌分别扩增出1 091,262和450bp的目的片段,从多种细菌DNA的混合种也可扩增出上述目的片段,而对其他对照组的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,建立的多重PCR最低可分别检测出200CFU/mL的嗜水气单胞菌、300CFU/mL的维氏气单胞菌和200CFU/mL的鮰爱德华菌;对临床样本的检出率为100%,与传统生物学检测结果的符合率为100%。【结论】建立的多重PCR检测方法特异、灵敏、快速,可单独或同时检测斑点叉尾鮰败血症嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌3种主要病原菌,也可以用于其他水生动物上嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌的检测。 相似文献
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根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列,设计1对特异性引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断方法。结果表明,扩增的阳性条带约为600 bp,特异性、敏感性结果显示,该PCR方法对致病性嗜水气单胞菌DNA的最低检测量为0.4 ng/L,而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的扩增结果均为阴性。对123份大鲵病料进行检测,结果建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验结果符合率为97.6%,表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测。 相似文献
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[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。 相似文献
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从东北三省养殖鱼类体内分离到21株嗜水气单胞菌,通过生理生化方法对该菌进行初步鉴定,然后根据已发表的嗜水气单胞菌16S rDNA基因和气溶素基因(Aer)的保守序列,设计2对引物,利用PCR方法对所分离到的21株嗜水气单胞菌以及参考株进行PCR扩增.结果表明,相对于常规的微生物生理生化检测,PCR对嗜水气单胞菌的检出率为90.48%.本方法的建立为常规理化检测方法提供辅助手段,从而更加有效、快捷的检测致病性嗜水气单胞菌,对东北三省地区水产养殖动物的疾病防治、流行病学调查等具有重要意义. 相似文献
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asd-1基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶,该酶可影响革兰氏阴性菌的细胞壁正常合成。为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)asd-1基因的功能,采用Overlap PCR方法敲除该基因,结果显示asd-1基因的敲除明显降低了嗜水气单胞菌的生长速度,但是不会导致突变株对二氨基庚二酸(DAP)的强制需求,进一步对氨基酸序列分析表明asd-1蛋白质较迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌的asd A蛋白质多出3个氨基酸,其中Asn-257导致asd A蛋白质中的关键活性位点Arg-267在asd-1蛋白质中改变为Val-267,该研究表明嗜水气单胞菌的asd-1基因突变显著降低其生长速度。 相似文献
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MGB探针实时定量PCR检测致病性嗜水气单胞菌 总被引：6，自引：0，他引：6
以嗜水气单胞菌气溶素（aerolysin）基因为待检靶基因,设计一对引物和一条MGB（Minor Groove Binder）探针,Aero基因探针5’端用FAM基团标记,3’端用TaqMan—MGB标记。建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法,可检测的最低细菌数为1．25×10^0CFU/μl;试验中嗜水气单胞菌检测结果均为阳性,而非嗜水气单胞菌检测结果均为阴性;重复性试验中,批间差异小于5％,批内差异小于3％。试验结果显示,荧光定量PCR方法可对致病性嗜水气单胞菌株进行快速鉴定。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。 相似文献
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嗜水气单胞菌的检测方法比较 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]比较实时荧光定量PCR法、PCR法及细菌培养法检测嗜水气单胞菌的灵敏度与特异性。[方法]在常规PCR法的基础上设计并建立了实时荧光定量PCR法,并采用该法与常规PCR及传统细菌培养法3种方法同时对嗜水气单胞菌进行检测与比较。[结果]实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达12.5 cfu/ml,达到了只需13个细菌就可得到阳性结果的灵敏度,具有很高的特异性,且检测速度快,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右,比传统细菌培养法和常规PCR法所需时间大大缩短。实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染。[结论]实时荧光定量PCR检测是3种方法中最为快速敏感的方法,是一种比较实用的嗜水气单胞菌的检测方法。 相似文献
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贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。结果显示研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。 相似文献
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[目的]对鳊鱼嗜水气单胞菌进行分离与鉴定。[方法]从鳊鱼中分离出嗜水气单胞菌,并进行16S rDNA特异性分子鉴定。分析嗜水气单胞菌的生化特征,并构建嗜水气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱。[结果]分离株的测序结果与GenBank中嗜水气单胞菌的标准菌株序列相似度达98%～99%。分离菌的生化特征结果均呈阳性。同一菌株的ERIC-PCR具有较好的重复性和稳定性,可用于嗜水气单胞菌的分型溯源。[结论]该研究为预防和控制鳊鱼出血病的发生和蔓延提供了参考。 相似文献
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[目的]建立贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法。[方法]根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比。[结果]所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。[结论]研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。 相似文献
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嗜水气单胞菌临床分离菌对抗菌药物的耐药性调查 总被引：1，自引：0，他引：1
摘[目的]了解嗜水气单胞菌的耐药性。[方法]从不同水生动物体内分离、鉴定出120株嗜水气单胞菌,采用纸片扩散法研究其对18种药物的耐药性。[结果]120株嗜水气单胞菌对阿米卡星和多西环素的耐药性较低,而对其他药物的耐药性均较强,其中,对p内酰胺类药物的耐药率为38％～90％;氨基糖苷类药物中,嗜水气单胞菌对阿米卡星的耐药率小于100k,而对其他药物的耐药性均较强;其他类药物中,对多西环素、环丙沙星和氧氟沙星的耐药率小于50％,而对其余药物的耐药率均在50％～77％〈之间;嗜水气单胞菌对阿米卡星、多西环素、环丙沙星和氧氟沙星的中介率较高。[结论]水生动物嗜水气单胞菌对抗菌药物具有较强的耐药性。 相似文献
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进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定 总被引：31，自引：0，他引：31
为了查明锦鲤暴发性疾病的病因，将患病锦鲤的脑，肝，脾和肾等组织悬液接种到CO，CK和EPS等鱼类细胞系中培养，均未发现细胞病变，从病灶中取样进行病原菌的分离和培养，证明锦鲤有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的感染，制备锦鲤疱疹病毒（KHV）的2对引物KHV9/5F和KHV9/5R，KHV1和KHV2，用嵌套式聚合酶链式反应（nested-PCR)在脑和脾脏组织的抽提物中扩增出长度为412bp的特异性的DNA片段，将该片段的nested-PCR拉增产物纯化后，克隆，测序，用NCBI-Blast软件将测序结果，在Genebank中进行搜寻，比较，结果发现与注册号为AF411803的KHV基因序列的一部分片段有99%的同源性，因此初步判断这次锦鲤暴发性疾病是由KHV引起的，副溶血弧菌和嗜水气单胞菌起着继发感染的作用。 相似文献