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体细胞核移植技术生产转入溶菌酶基因(hLYZ)牛胚胎的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究主要探讨经基因修饰和筛选后转基因供体细胞的挑选及处理对牛转入溶菌酶基因克隆胚胎早期发育的影响.用含人溶菌酶基因(human lysozyme,hLYZ)乳腺特异表达载体pEBH重组质粒转染高产荷斯坦牛成纤维细胞,经G418筛选后的转基因阳性细胞作为核供体细胞成功构建了转hLYZ基因克隆胚胎.结果发现,基因转染及筛选过程对转基因重构胚的发育有不利的影响,囊胚发育率显著降低;以注核针内径为参照,挑选直径为15～20μm的转基因阳性细胞作为供体细胞,重构胚的融合率和囊胚率较其它组差异显著(分别为80.4%和33.8%,P<0.05);生长旺盛期的细胞构建的转基因克隆胚的卵裂率及囊胚发育率显著高于经血清饥饿和生长接触抑制处理组(P＜0.05);所有的转基因克隆胚在体外发育的各个发育时期都能观察到绿色荧光蛋白的表达,但表达的强弱在不同个体及相同个体不同发育时期之间存在差异.随机挑选10枚囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为阳性转基因胚胎.研究结果表明,利用体细胞核移植方法可以获得转舰hLYZ基因的克隆胚胎,重构胚可成功的发育到囊胚阶段;挑选生长旺盛期的直径为15～20 μm的转基因阳性细胞作为供体细胞可显著提高转基因克隆胚的融合率和囊胚率. 相似文献
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人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大肠杆菌中的表达 总被引：2，自引：2，他引：2
根据人β-防御素-3(hBD3)和植物甜蛋白Brazzein(Bra)的成熟区氨基酸序列，按照细菌密码子的偏爱人工合成了7对末端具粘合位点的核苷酸序列。经连接和PCR扩增，使人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein的编码序列通过一段序列（含凝血酶切割位点涟接成为嵌合DNA。将其插入到pET30a的T7启动子之下，构建成了防御素和甜蛋白双价基因的表达载体pET30a-hBDs-Bra，在大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中诱导表达后，得到了与预计分子量相同的蛋白，约占总蛋白的30．5％，产量约为1．4～2．8mg/mL。 相似文献
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转兔防御素基因（NP-1）玉米植株的获得及其抗病性分析* 总被引：3，自引：0，他引：3
首次报道了采用基因枪法将兔防御素基因(NP-1)导入玉米(Zea mays L．)不同杂交组合胚性愈伤组织中获得了T0再生植株。分别通过PCR和DNA点杂交证实．NP-1基因已经整合到部分T0代玉米基因组中。PCR和Southern杂交证实NP-1基因已经稳定遗传至部分T1代玉米植株中。RNA点杂交结果表明部分T1代转基因玉米中NP-1基因能够进行正常转录。在Tl代玉米5～7叶期接种玉米大斑病菌(Helminthosporium turcicum Pass)0号生理小种，发现转兔防御素基因玉米能有效抵抗玉米大斑病的侵袭。 相似文献
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用设计的特异性引物，采用RT-PCR技术特异性地扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（简称Gal-1）～Gallinacin-13（简称Gal-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列，并提交到GenBank中获得胡须鸡β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因的注册号为：DQ858311~ DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1、1（a）～Gal-13基因分别与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性，其氨基酸的同源性均在96.5～100％之间。利用Clustalx软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果Gal-1与Gal-1（a）、3在同一分支上，Gal-4、5、8在同一分支上，Gal-2、12、13在同一分支上，Gal-6、7在同一分支，Gal-9、10在同一分支，Gal-11独在一分支上。同样用RT-PCR方法分析了胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布，结果发现:Gal-1/2/4/5/6/7/10的表达分布非常广泛，Gal-3/8/9/11/12/13的分布少。 相似文献
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鸡β-防御素基因的克隆与结构分析 总被引：5，自引：1，他引：5
通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。 相似文献
6.
本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。 相似文献
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应用LA-PCR的方法,从荷斯坦牛基因组中成功地扩增获得6.0 kb和1.78 kb两个基因片段,其中6.0 kb包括αs1-酪蛋白基因5′调控序列到第三内含子部分,1.78 kb包括αs1-酪蛋白基因第十二内含子到第十四内含子之间序列,作为打靶载体的同源臂;从新生儿血液基因组中扩增获得5.5 kb的血小板生成素（thrombopoietin,TPO）基因组序列,包括第一内含子部分序列到3′终止子后的序列。以水牛β-酪蛋白基因的5′调控区4.4 kb片段为启动子,以pLoxp质粒为打靶载体骨架,加上同源臂片段和目的基因TPO的片段,经多步酶切-连接-转化-筛选-鉴定基因重组过程,最终建成长达25 kb的人TPO基因定点整合荷斯坦牛αs1-酪蛋白基因打靶载体,PCR和酶切分析表明载体构建正确,为研制定点整合荷斯坦牛乳腺生物反应器奠定了基础。 相似文献
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异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体.然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP又称CD47),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除.本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入hCD47基因,制备表达hCD47基因的GTKO/hCD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬.首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin promoter,CAG)调控的hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪.利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定,通过qRT-PCR、Westem blot和免疫组化等方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达.抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况.通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪,PCR鉴定均为hCD47基因阳性猪.qRT-PCR结果显示,hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏.Western blot及免疫组化结果进一步证实hCD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达,与qRT-PCR结果一致.血液生理指标显示,存活仔猪健康状况良好.本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪,确证了hCD47基因在主要器官中的表达特征,将有助于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应. 相似文献
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用设计的特异性引物，采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（Ga1-1）-Gallinacin-13（Ga1-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列，GenBank登陆号为：DQ858311-DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Ga1-1（a）-Ga1-13，Ga1-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性，均在96．5％-100％之间。利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析，结果显示Ga1-1、Ga1-1（a）、Ga1-2、Ga1-3、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7、Ga1-8、Ga1-12和Ga1-13在同一大的分支上；Ga1-9和Ga1-10在同一分支；Ga1-11独在一分支上。用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Ga1-1－Ga1-13基因在不同组织中的分布，结果发现：Ga1-1、Ga1-2、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7和Ga1-10的表达分布非常广泛，Ga1-3、Ga1-8、Ga1-9、Ga1-11、Ga1-12和Ga1-13的分布少。 相似文献
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植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。 相似文献
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以贵州禾来拢幼胚为转化受体,用农杆菌介导法将几丁质酶和抗除草剂抗性双价基因（CHI-PAT）导入来拢幼胚,筛选出抗性愈伤组织并获得抗性植株.抗性植株经GUS组织化学及PCR检测呈阳性,转基因植株对50 mg/L的Basta溶液有抗性.初步证明CHI和PAT基因已整合进了水稻基因组中. 相似文献
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肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉发育的负调控基因,突变后会引起肌肉的过度发育,在肉用动物育种中有非常重要的价值。本研究利用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)对牛(Bos taurus)MSTN基因的第二外显子特异性剪切,诱导该基因的突变,从而达到敲除该基因的目的。首先对脂质体介导的双质粒共转染牛成纤维细胞的条件进行优化,获得的共转染效率高达19.27%;之后利用两组ZFNs对牛成纤维细胞进行转染,单细胞通过口吸法移入96孔板,经扩大培养后进行PCR筛选,获得18株MSTN基因突变细胞株,其中包括一株双等位基因敲除的细胞系,两组ZFNs对牛成纤维细胞的突变效率分别为6.05%和3.84%;最后,挑选一株突变细胞系进行体细胞核移植研究,共获得24枚重构胚;将去除透明带的重构胚培养于2i培养液中,获得囊胚来源的类滋养层干细胞,通过PCR和测序检测,证明该细胞系在MSTN基因第二外显子具有与供体细胞相同的突变。结果表明,所合成的两组ZFNs可以在MSTN作用位点引起突变,具有很高的突变效率,而且能获得双等位基因突变的细胞株,获得的细胞株能够用作体细胞核移植的供体细胞。本研究为肉用牛的品质改良和育种工作提供了基础资料。 相似文献
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对乳糖诱导工程菌株BL-pET-hBD3-Bra表达的人β防御素3和植物des-pGlu1-Brazzein融合蛋白进行了纯化和活性分析。并对工程菌株的乳糖诱导表达条件进行了优化。对目的蛋白的活性分析表明,hBD3-Bra融合蛋白有一定的甜味,但是杀菌活性很弱,经凝血酶切割后,重组hBD3有明显的抑菌活性,des-pGlu1-Brazzein的甜度大约为蔗糖甜度的600倍。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示：高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用（P<0.01）,对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05);时间延长对于菌株生长有利（P<0.01）,对目的蛋白的表达无显著影响（P>0.05);温度对菌株生长和目的蛋白的表达均有显著影响（P<0.01）。进一步的研究表明,菌株在30℃-32℃生长,在30℃诱导最优,乳糖和IPTG的诱导结果无显著差异（P>0.05)。 相似文献
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为了测定牛体外受精胚胎移植到受体母牛后的怀孕率和双胎率，本研究共进行了３个胚胎移植试验。试验１，测定新鲜胚胎移植后的怀孕效果。将１６０枚新鲜胚胎移植到８０头受体母牛（每头受体接受２枚胚胎），移植后６０～９０ｄ的怀孕率为６５％（５２／８０），其中双胎率为５０％（２／５２）。试验２，测定经室温保存４～１８ｈ的胚胎移植后的怀孕效果。供试验用的６８头受体母牛均于移植前７ｄ（即发情当天）进行人工授精。移植时每头受体牛接受１枚胚胎。移植后４０～６５ｄ的怀孕率为７６．５％（５２／６８），其中双胎率为６５．４％（３４／５２）。试验３，测定冷冻胚胎移植后的怀孕效果。将４５４枚冷冻胚胎移植到２２７头受体母牛，每头接受２枚冻胚。移植后５０～６０ｄ的怀孕率为６１．７％（１４０／２２７），其中双胎率为２５％（３５／１４０）。本研究结果表明，用完全体外化技术生产的牛胚胎移植到受体母牛后可获得满意的怀孕率和双胎率，这一技术将为加速向用牛生产的发展开辟一条崭新的途径。 相似文献
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为了克隆奶牛Oct4基因开放性阅读框全序列,并建立高效、稳定产生逆转录病毒质粒pMSCV-Oct4的包装细胞株.我们以50～60日龄的胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR的方法扩增出牛Oct4基因全序列,全长为1 083 bp与GenBank公布的序列的同源性为99.4%.将其插入到逆转录病毒载体pMSCVneo的多克隆位点,获得重组逆转录病毒质粒pMSCVneo-Oct4.鉴定正确后,通过Lipofectamine2000将其转导入包装细胞PT67,用含有G418的培养液进行抗性筛选,获得阳性细胞克隆.细胞上清经过RT-PCR、透射电镜及病毒滴度测定等方法鉴定,证实所包装病毒存在,其滴度值为8.83×107 cfu/mL.试验结果表明我们已获得携带牛Oct4基因的高滴度感染性逆转录病毒. 相似文献
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用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1(Gal-1)～Gallinacin-13(Gal-13)共13个基因编码区全长片段.通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,GenBank登陆号为:DQ858311～DQ858323.比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1(a)～Gal-13,Gal-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性.均在96.5%～100%之间.利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果显示Gal-1、Gal-1(a)、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-8、Gal-12和Gal-13在同一大的分支上;Gal-9和Gal-10在同一分支;Gal-11独在一分支上.用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布,结果发现:Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7和Gal-10的表达分布非常广泛,Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12和Gal-13的分布少. 相似文献
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本研究以β2-肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR)基因的保守序列设计了1对PCR引物,通过PCR技术首次获得了萨福克、小尾寒羊和中国美利奴(新疆型)3个绵羊(Ovis aries)品种的β2-AR基因(GenBank登录号分别为EU707939、EU707940和EU707941),该基因含一个1 257 bp的开放阅读框(ORF),编码418个氨基酸残基.核苷酸序列分析显示,绵羊β2-AR基因与牛、猪、大鼠和人的相似性分别为98.4%、88.5%、84.2%和80.5%.通过基因合成技术合成了双拷贝的绵羊β2-AR第二细胞外环编码区DNA,并将其与pET32C(+)重组.重组菌以1 mmol/L IPTG诱导,通过SDS-PAGE和Western blot分析,绵羊β2-AR第二细胞外环融合蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达,表达产物分子量约为26 kD,表达水平最高占菌体总蛋白的40.3%. 相似文献
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摘要：以生产上优良旱稻（Oryza sativa L. ）新品种旱稻297、旱稻10号等的幼胚愈伤组织为转化受体材料，用基因枪法把抗Basta除草剂的bar基因导入了这些品种的愈伤组织，经两轮Basta抗性筛选和分化获得了再生植株，对再生植株进行PCR扩增和Southern杂交检测，T0和T1代Basta抗性实验表明，bar基因已整合到旱稻的基因组DNA中，并在T1代继续表达。对各品种幼胚培养的诱导、分化培养基实验表明，MB和MS培养基可作为这5个品种的愈伤组织诱导培养基，改良的RMB2、RMS2培养基可显著地提高愈伤组织的分化频率。实验所获得的转基因植株和建立的遗传转化系统，为旱稻的抗除草剂分子育种和其它基因转化奠定了初步的基础。 相似文献
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通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。 相似文献
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通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛(Bos tarus)的增食欲素受体1(HCRTR1)基因编码区全长,获得1 278 bp编码区全长序列(GenBank登录号:DQ874350),将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%.阳性质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,将目的片段定向克隆到pET32a( )表达载体上,转化B121(DE3)感受态大肠杆菌(Escherichia coli),经鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE表明,秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达,进一步生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,复杂的蛋白质结构使得其不能在原核表达系统中获得表达. 相似文献