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1.
根据GenBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)保守基因序列(AF218226),设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术.将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比.结果显示,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达2个拷贝,比常规PCR灵敏度高1 000倍.对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV阳性的DNA样品进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为2.15×107～4.21×104拷贝/μL.用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测,表明该方法具有良好的重复性,可满足IHHNV的临床诊断需要. 相似文献
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根据G enBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒( IHHNV) 保守基因序列( AF218226), 设计合成了1对引物和1条TaqM an探针, 建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术。将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比。结果显示, 所建立的荧光定量PCR 方法灵敏度可达2个拷贝, 比常规PCR 灵敏度高1 000倍。对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV 阳性的DNA 样品进行荧光定量PCR检测, 结果都为阳性, 检测的病毒含量为2. 15 @ 107 ~ 4. 21 @ 104 拷贝/LL。用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测, 表明该方法具有良好的重复性, 可满足IHHNV的临床诊断需要。 相似文献
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根据偷死野田村病毒(CMNV)的保守基因序列,设计筛选出1对特异性引物CMN279,利用已公布的凡纳滨对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)特异性引物WSS235和IHHN356,建立了一种同时检测WSSV、IHHNV和CMNV的多重PCR检测方法。收集18种病原、健康对虾组织及WSSV、IHHNV、CMNV阳性病料,开展特异性测试,该方法可以特异性扩增出WSSV、IHHNV、CMNV基因片段,健康对虾肌肉组织、其他18种病原均未扩增出任何片段,特异性强。应用克隆方法制备目的基因质粒,应用连续稀释质粒方法开展灵敏度测试,测定该方法检测灵敏度分别为WSSV 9.74fg、IHHNV7.65fg、CMNV 10fg;与已报道的多重PCR检测灵敏度相比较,检测灵敏度提高10倍。应用本研究建立的多重PCR检测方法与实验室标准检验方法同时进行22个样品检验,多重PCR检验方法的检验结果与实验室标准方法检验结果符合率为100%。上述实验结果表明:本研究建立的多重PCR检验方法具有特异性强、灵敏度高、检验时间短、检验结果准确度高的特点,可用于WSSV、IHHNV和CMNV三种病原的快速检测诊断。 相似文献
4.
为了快速有效地检测养殖对虾的对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV),建立了WSSV和IHHNV的双重环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并以钙黄绿素荧光目测方法和电泳方法分别观察和检测结果。通过扩增序列分析发现,WSSV的LAMP扩增靶序列中存在HinfⅠ酶切位点,而IHHNV的LAMP扩增靶序列中没有此酶切位点,因此可以利用内切酶酶切反应来区分两种病毒的扩增产物。试验结果显示,所建立的双重LAMP方法具有较好的灵敏性和特异性。将所建立的检测方法进行临床应用,对湛江地区养殖场对虾WSSV和IHHNV的流行情况进行调查,结果发现,湛江地区养殖场WSSV和IHHNV感染率较高,且在低日龄虾苗中有感染情况。本研究所建立的LAMP方法不需要严格的仪器设备,反应快速、操作简单,适用于口岸检疫和条件相对落后的基层实验室进行疫病的快速检测。 相似文献
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对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)可感染世界各地养殖对虾,给对虾养殖业造成严重经济损失。本实验首次采用实时定量PCR法对广西地区的84份凡纳滨对虾样品进行检测,同时以常规PCR检测作对照。实时定量PCR检测阳性率为79·8%,常规PCR检测阳性率为40·5%,表明广西地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV的感染率较高。将二者检测均呈阳性的30份样品扩增产物进行序列分析测序,测序结果通过DNA STAR软件包进行分析,并通过NCBI Blast与GenBank中的序列进行比对。结果证明,测定的是IHHNV序列。30份样品的IHHNV序列很保守,可以分为4种类型,仅有两个碱基的位置发生变异。实时定量PCR检测IHHNV,快速、灵敏、准确,特异性好,可以作为检测对虾感染病毒的有效方法。 相似文献
6.
PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) 总被引：10，自引：1，他引：10
利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng／μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNV DNA的检出灵敏度为24．8pg,可检出26．6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250．4ng健康虾组织DNA、202．5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病学调查,并具有较高的应用价值。 相似文献
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为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。 相似文献
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白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因保守序列,利用Primer Explorerv 4.0软件设计了4条引物,建立了白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化,同时将建立的LAMP检测方法与巢式PCR进行了比较分析。结果表明,LAMP最适反应在64℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果。LAMP方法的最低检出限为100拷贝/μL,灵敏度较巢式PCR高100倍,而且LAMP方法在1h内即可完成检测,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果。用建立的LAMP方法对临床发病南美白对虾样品进行了检测,结果表明,LAMP方法适合对虾白斑综合征病毒的现场快速检测。 相似文献
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本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。 相似文献
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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) PCR检测方法的建立 总被引：6，自引：1，他引：6
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布较广,危害严重,对世界对虾养殖业发展影响重大.本文根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了1对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和感染IHHNV凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19.85fg(8.83×103病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、对虾白斑综合征病毒(WSSV) DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV) DNA无交叉反应.本方法可快速、灵敏、特异地检测出对虾感染和携带IHHNV状况,为对虾健康养殖、无特定病原(SPF)种群选育及流行病调查提供了有效的检测手段. 相似文献
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二温式PCR检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
根据对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)基因序列,设计了1对可以扩增356 bp IHH-NV某段基因序列的特异性引物,优化建立了能快速检测IHHNV的二温式PCR。特异性试验和敏感性试验结果表明,该技术只对IHHNV DNA模板进行扩增,得到356 bp的DNA扩增片段,而对SPF南美白对虾组织DNA和其它对虾病原DNA/RNA的扩增结果为阴性;该技术最低能检测到10 pg的IHHNV感染对虾组织样品总DNA。应用该技术对400份对虾临床样品进行检测,结果有96份样品呈现阳性,表明该病在我国南方的养殖对虾中广泛存在,二温式PCR技术可以直接用于该病的临床快速检测和流行病学调查。 相似文献
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哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起海南省后水湾深水网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)"烂身病"的主要病原菌。为了能够快速诊断该病原菌,急需建立一种耗时短、准确以及便捷的检测方法。本研究利用分离到的致病菌株QT520的ToxR基因序列设计特异性引物和加入SYTO-9特异荧光染料,建立了一种可以实时、快速检测哈维氏弧菌的LAMP法(RT-LAMP)。该方法对哈维氏弧菌的基因组DNA及菌液灵敏度分别为100 fg/μL和10~3 cfu/mL,与Real-time PCR法检测灵敏度相当,比普通PCR的检测灵敏度要分别高1000倍和10倍,能有效区分哈维氏弧菌与坎氏弧菌(Vibrio campbellii);可以实时观察检测结果,且检测时间只需要40 min;具有耗时短、特异性和灵敏度高、仪器便携、操作简单且能实时观察检测结果等优点,非常适合在生产现场进行哈维氏弧菌的检测。 相似文献
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本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。 相似文献
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根据Genbank中对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）的基因序列，设计了两对能分别检测WSSV和IHHNV保守片段基因的特异性引物，而且这两对引物在同一反应体系中可以同时对WSSV和IHHNV的DNA模板进行多重PCR扩增，得到大小分别为110bp（WSSV）和356bp（IHHNV）的扩增条带。对影响PCR反应的主要因素Mg“浓度和退火温度进行了优化，证明当Mg^2＋浓度为2．0～4．0mmd，退火温度为57～59℃时可获得最佳的扩增和检测效果。特异性试验结果表明，这两对引物检测WSSV和IHHNV具有很好的特异性，对其它对虾常见病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明，该反应体系最低能检测100pg的WSSV和IHHNV的DNA模板。临床检测表明，所建立的双重PCR方法可以适用于WSSV和IHHNV的同时检测和鉴别。 相似文献
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为了快速、方便地检测出这2种病毒,研究将PCR核酸扩增的高灵敏度和胶体金免疫层析技术快速、简便、直观的优点结合起来,建立了同时检测2种对虾病毒(WSSV和IHHNV)的同步PCR-胶体金免疫层析检测方法。采用了生物素标记和地高辛(Digoxigenin)标记引物。PCR扩增产物利用胶体金免疫层析技术进行检测。胶体金免疫检测试剂条的检测线(T线)处的层析膜处点上地高辛的单抗,经地高辛标记的PCR扩增产物可在T线上被检测到,在10 min内即可得到检测结果。同时,在PCR过程中使用UNG(尿嘧啶-DNA糖基酶),极大地控制了遗留污染。通过此方法检测对虾WSSV和IHHNV病毒的灵敏度均可达到10~100个拷贝,高于国家标准PCR检测法10~100倍。此检测方法让工作人员避免了接触有毒和诱导突变的试剂,免除基层检测实验室购买电泳设备和荧光检测系统的投资。 相似文献
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2013年,河北、天津等地区养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗期出现死苗、出苗率低的情况,生产上,仔虾个体大小差异较大,造成了严重损失.本研究采用荧光定量PCR方法(Real-time PCR)对天津大港地区采集的108尾凡纳滨对虾仔虾样品进行单尾病原检测.结果显示,传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)均有检出.IHHNV阳性检出率100％,每微克对虾组织DNA的病毒拷贝数为103-107,且个体较大的样品(1.2-2.0 cm)携带病毒拷贝数偏高;EHP阳性检出率为49.1％,每微克对虾组织DNA的拷贝数为103-105,且集中于个体较小样品(0.7-1.1 cm).对IHHNV和EHP阳性凡纳滨对虾样品进行生物学体长与病毒载量指数相关性分析,显示IHHNV载量指数与对虾生长速率呈正相关,虾组织IHHNV平均载量达8.51×104 copies/μg DNA,为较高的感染水平;EHP的载量与对虾生长速率呈负相关关系,与较大个体阳性检出率较低相对应,虾组织EHP平均载量达到2.19× 104 copies/μg DNA,为较高的感染水平.由此,该批凡纳滨对虾仔虾患病为IHHNV和EHP的混合感染所致,本研究数据为IHHNV和EHP病原混合感染流行情况及其对养殖育苗期仔虾生长的影响提供科学依据. 相似文献
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奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两批菲律宾蛤仔样品进行检测,结果表明,LAMP检测与传统PCR检测相比,灵敏度更高,检测结果更准确。实验所建立的奥尔森帕金虫LAMP检测方法简单、快速、灵敏且特异性强,可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用。 相似文献
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为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。 相似文献
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根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。 相似文献
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根据GenBank中(鱼师)鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测(鱼师)鱼诺卡氏菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10-6 μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性.应用建立的方法在(鱼师)鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果100％相符.既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值.结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于鱼类致病(鱼师)鱼诺卡氏菌的快速检测. 相似文献