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1.
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的SYBR-Green 1实时荧光定量PCR方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性和重复性较好。【结论】建立了检测PCV2的SYBR-Green 1荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析PCV2感染程度奠定了基础。 相似文献
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【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测,计算其符合率。【结果】成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,当NS1基因含量为(2.67×102)~(2.67×107)拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.998,扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为2.67×102拷贝/μL;特异性强,对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%~1.17%和0.51%~1.82%。对临床送检的15份病料,TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15),RTPCR方法的阳性率为60.0%(9/15),2种方法的符合率为100.0%。【结论】建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法,该方法可应用于ATmV感染的早期检测。 相似文献
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鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。 相似文献
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《南方农业学报》2015,(3)
【目的】建立奶牛G蛋白偶联受体109A基因(GPR109A)的实时荧光定量PCR检测方法,为开展奶牛产后脂类代谢紊乱及酮病发生机理研究奠定基础。【方法】根据Gen Bank中奶牛GPR109A基因和β-actin基因(内参基因)的m RNA保守序列设计合成两对引物,以奶牛肝脏组织c DNA为模板,PCR扩增目的基因后与载体连接构建重组质粒,以SYBR Green I实时荧光定量PCR进行扩增,绘制标准曲线,并对其特异性、敏感性、重复性等进行检验。【结果】GPR109A基因和β-actin基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程分别为y=-3.309x+10.92(R2=0.9985)和y=-3.289x+9.794(R2=0.9997),扩增效率分别为101.0%和100.0%。特异性试验结果显示,GPR109A基因和β-actin基因的溶解曲线峰单一,无引物二聚体和非特异性扩增产物生成;敏感性试验结果显示,线性扩增范围广,可检测到1.8×102个拷贝的GPR109A基因;重复性试验结果显示,各扩增反应的变异系数(CV)小于或等于1.7%。【结论】基于GPR109A基因建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可用于牛源性GPR109A基因表达量的快速检测和定量分析。 相似文献
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6.
【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。 相似文献
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【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR方法进行比较。【结果】建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线的斜率为-3.383,R2=0.998,具有良好的线性关系;重复性试验结果表明,该方法循环数阈值Ct的变异系数(CV)为0.86%～1.02%,具有良好的稳定性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为5.06copies/μL;特异性检测结果显示,该方法对猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,对PCV-2标准品的检测结果为阳性,说明该方法具有较好的特异性。临床样品的检测中,所建立的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。【结论】成功建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对PCV-2的检测。 相似文献
8.
【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。 相似文献
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【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg2+终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID50/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。 相似文献
10.
黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测. 相似文献
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【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。 相似文献
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《四川农业大学学报》2013,(4):427-432
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测鸡马立克氏病病毒(MDV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法。【方法】针对马立克氏病毒特异的Meq基因序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ染料建立检测马立克氏病毒的实时荧光定量PCR方法,进行敏感性、特异性、重复性试验,并应用该方法检测了罗曼蛋鸡、AA肉鸡、二郎山山地鸡SD02和SD03品系4种鸡只感染组和对照组样本的脾、法氏囊、胸腺等组织中的病毒拷贝数。【结果】该方法建立的定量标准曲线荧光阈值循环数(Threshold cycle,Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.996),扩增效率(E)为96%,熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,敏感性和重复性试验证明该方法具有较高的灵敏度和稳定性,最低检测浓度为102拷贝/μL。同时运用该方法对试验样本进行检测,结果显示在4个感染组鸡只的肝,脾,肾,胸腺,法氏囊组织中均检测出Meq的拷贝,并计算出了待测样品的病毒拷贝数,相反在未感染组却没有检测出任何Meq的拷贝。试验结果还发现二郎山山地鸡两品系各组织中MDV的拷贝数显著低于AA肉鸡和罗曼蛋鸡各组织。【结论】建立的检测方法能够快速检测马立克氏病毒,结果准确,成本低廉,可以将其作为生产上监控马立克氏病的一个重要手段。 相似文献
13.
为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测. 相似文献
14.
[目的]建立奶牛G蛋白偶联受体109A基因(GPR 109A)的实时荧光定量PCR检测方法,为开展奶牛产后脂类代谢紊乱及酮病发生机理研究奠定基础.[方法]根据GenBank中奶牛GPR 109A基因和卢-actin基因(内参基因)的mRNA保守序列设计合成两对引物,以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增目的基因后与载体连接构建重组质粒,以SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR进行扩增,绘制标准曲线,并对其特异性、敏感性、重复性等进行检验.[结果]GPR109A基因和β-actin基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程分别为y=-3.309x+10.92(R2=0.9985)和y=-3.289x+9.794(R2 2=0.9997),扩增效率分别为101.0％和100.0％.特异性试验结果显示,GPR 109A基因和β-actin基因的溶解曲线峰单一,无引物二聚体和非特异性扩增产物生成;敏感性试验结果显示,线性扩增范围广,可检测到1.8×102个拷贝的GPR109A基因;重复性试验结果显示,各扩增反应的变异系数(CV)小于或等于1.7％.[结论]基于GPR109A基因建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可用于牛源性GPR109A基因表达量的快速检测和定量分析. 相似文献
15.
【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×107～1.0×101拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。 相似文献
16.
【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示：建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。 相似文献
17.
《新疆农业科学》2017,(1)
【目的】建立一种快速、准确的鼠李糖乳杆菌检测方法。【方法】根据已报道的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的gyr B基因保守序列,设计用于检测鼠李糖乳杆菌的特异性DPO引物,结合SYBR Green I实时荧光PCR技术,建立鼠李糖乳杆菌的实时荧光PCR检测方法,评价其特异性和灵敏度,并将建立的检测方法用于实际样品的检测中。【结果】该方法对2株鼠李糖乳杆菌能得到阳性扩增,而其余10种乳酸菌及阴性对照没有扩增曲线,而且在退火温度为50~60℃不影响其特异性;该实时荧光PCR检测灵敏度比农业部标准中普通PCR检测高10倍;用10种微生物肥料及其它益生菌产品进行了验证,检出情况与产品标识一致。【结论】研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR能够准确、高效的检测微生物肥料及其他益生菌产品中的鼠李糖乳杆菌。 相似文献
18.
【目的】建立一种快速简便检测绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)的方法。【方法】根据Mo膜蛋白P80基因序列,利用Oligo 7软件设计并筛选出特异性扩增引物,通过条件优化建立检测Mo的RPA方法。【结果】该方法可特异性扩增Mo,对其他羊常见病原无特异性扩增,对Mo核酸的检测灵敏度为70fg·μL-1,与常规PCR敏感性一致。批内和批间结果显示Mo阳性样品均能扩增条带,而阴性对照均无扩增,表明重复性好。对186份临床样品应用建立的RPA方法和常规PCR方法同时进行检测,并对其中40份肺脏样品进行支原体的分离鉴定,结果显示分离鉴定出的13份Mo阳性样品及常规PCR法检测出的95份阳性样品经RPA检测,结果均为阳性。【结论】建立的Mo RPA方法特异性强、重复性好,可作为Mo的快速检测和流行病学调查的一项候选技术。 相似文献
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摘要：【研究目的】建立猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank中核苷酸序列设计猪淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的特异性引物,经RT-PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品cDNA进行检测,构建LFA-1和CTLA-4荧光定量RT-PCR标准曲线。【结果】以1×109~1×102拷贝/μL不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后,统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系（LFA-1：RSq =0.992;CTLA-4：RSq =0.994）;样品检测显示LFA-1与CTLA-4引物的扩增曲线图和熔解曲线图的特异性。【结论】所构建的质粒标准品具有线性关系好、重复性好、敏感性高等特点,以及其引物在样品检测中的可应用性,为分析猪免疫细胞在感染病毒前后LFA-1和CTLA-4表达的变化以及评估猪体免疫功能,提供必要的技术平台。 相似文献
20.
【目的】建立检测胞内劳森菌的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,为猪增生性肠炎的准确诊断奠定基础。【方法】针对胞内劳森菌16SrDNA序列设计引物,扩增16SrDNA,构建pT-LI-16S重组质粒。以pT-LI-16S为模板建立检测胞内劳森菌的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,检测其特异性、敏感性和重复性,并用该方法对51份疑似增生性肠炎病例进行检测。【结果】建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法特异性强,与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副猪嗜血杆菌等无交叉反应;在标准质粒含量为1.0×102~1.0×108拷贝/μL时,质粒含量与循环阈值(Ct)之间具有良好的线性关系(R2=0.992),最小可检测到10拷贝/μL的重组质粒;重复性检测显示其批内变异系数小于2%。该方法对粪便及小肠组织中胞内劳森菌的检出率分别为46.9%和84.2%,高于普通PCR的检出率(分别为40.7%和78.9%)。【结论】建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,能对胞内劳森菌进行快速检测及定量分析,可用于猪增生性肠炎的诊断。 相似文献