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1.
含与不含前导序列的乙肝病毒表面抗原在转基因番茄中表达的研究 总被引：24，自引：2，他引：22
将携带有乙型肝炎病毒（ａｄｗ亚型）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因和ＨＢｓＡｇ及其前导序列（ＨＢｓＡｇ＋ｐｒｅＳ１＋ｐｒｅＳ２）基因的植物表达载体ｐＲＯＫＩＩ，分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中，通过叶盘转化法得到转基因番茄及其后代。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证明现任中外源基因已插入到植物染色体中。ＥＬＩＳＡ检测结果表明用ＨＢｓＡｇ基因转化的番茄叶片和果实中都能表达ＨＢｓＡｇ，而用含ｐｒｅＳ的ＨＢｓＡｇ基 相似文献
2.
将携带有乙型肝炎病毒表面抗原基因和ＨＢｓＡｇ及其前导序列基因的植物表达载体ｐＲＯｋⅡ,分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中,通过叶盘转化法得到转基因番茄及其后代。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证明两种外源基因已插入到植物染色体中。 相似文献
3.
采用PCR方法从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组扩增其外毒素A（PEA）全长编码基因,并将PEA基因插入到pcDNA3.1A真核表达载体中,构建成pcDNA3.1/ PEA质粒表达载体。经磷酸钙介导将重组质粒转染 HEK293T 细胞进行表达。结果表明本文克隆的PEA基因与标准菌株PA103碱基序列基本相似,同源性达99%。表达产物经蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测,表明本文构建的含有原基因信号肽的PEA基因能够在真核细胞进行分泌性表达,这为基于PEA的免疫毒素、疫苗佐剂和疫苗载体的研究奠定了基础。 相似文献
4.
巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPICINU是利用来源于克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因信号肽DNA序列（ISP）构建的。表达实验结果表明，带有分泌表达载体pPICINU的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌，具有与带有表达载体pPIC9K(带有α因子信号肽）的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。 相似文献
5.
鸡输卵管组织特异性分泌表达载体的构建和表达 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要：为了实现外源基因在鸡(Gallus gallus )输卵管上皮细胞内的特异性分泌表达，采用RT-PCR的方法扩增了鸡溶菌酶基因的450 bp的cDNA片段，该片段保留了5ˊ端信号肽编码序列。将该片段插入到含有1.2 kb卵清蛋白5ˊ调控序列的特异性表达载体pOVA-GFP中，与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，使融合蛋白具有分泌功能。新构建的分泌表达载体pOVALG转染鸡胚成纤维细胞和大鼠乳腺上皮细胞系SHZ-88后，成功地检测到了绿色荧光蛋白的表达。 相似文献
6.
本研究把含有β干扰素基因的植物表达载体ｐＧ２１（含有β干扰素基因的信号肽）和ｐＧ１１通过三亲结合转移到了农杆菌Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ２２６０）中，并与ｐＧＶ２２０６０发生同源重组而稳定存在于它Ｔｉ质粒ｐＧＶ２２６０上，进一步用此载体把β干扰素工因转移到了烟草细胞中Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析证明了此基因已整合到染色体上，ＲＮＡ点杂交及ＮＰＴⅡ酶分析显示此基因植物细胞中得到了表达，实验中还发现含有ｐＧ２１的农杆 相似文献
7.
水稻psb A启动子诱导的GUS基因在烟草叶绿体中的瞬间表达 总被引：4，自引：1，他引：4
利用水稻ｐｓｂＡ基因的启动子与ＧＵＳ基因融合构成叶绿体瞬间表达载体ｐＲＧ６，通过基因枪法将该质粒导入烟草叶片细胞叶绿体中，得到ＧＵＳ基因的瞬间表达。ＧＵＳ反应产生的监色沉淀局限于细胞内某一特写区域，而在核质表达载体ｐＢＩ１２１转化的细胞中蓝色沉淀分布于整个细胞质中。实验表明单子叶植物叶绿体水稻ｐｓｂ Ａ基因的启动子可以十分有效地在双子叶植物烟草细胞叶绿体中起作用，在观察时采用了植物组织切片中的二甲 相似文献
8.
菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶（SAD）基因的分子克隆 总被引：3，自引：0，他引：3
本研究以菠菜为材料，参考Ｎｉｓｈｉｄａ等人发表的ＳＡＤ基因序列，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从菠菜的总ＲＮＡ中扩增出了一条约１．３ｋｂ的片段。扩增片段克隆后进行了核苷酸序列分析，结果表明，扩增片段包含了硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因的完整阅读框。从其完整阅读框的核苷酸序列推导出的氨基酸序列来看，菠菜ＳＡＤ由３９９个氨基酸残基组成，分子量约４５．７ｋＤ，氨基端３５个氨基酸残基为其转运到叶绿体的信号肽。 相似文献
9.
海藻糖合酶基因的克隆及转化甘蔗的研究 总被引：10，自引：0，他引：10
从提子菌灰树花的菌丝体中提取总ＲＮＡ,并纯化出ｍＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到一长约２．２ｋｂ的片段,经测序,其全长２１９９ｂｐ,包括起始密码和终止密码;随后将此片段插入植物表达载体ｐＢＩ１２１的３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子之间,构建了一植物表达载体（ｐＢＴ）,又将此片段加上ｕｂｉ－Ｌ启动子和ＮＯＳ终止子构建了另一植物表达载体（ｐＵＢＴ）,然后通过基因枪法分别用植物表达载体ｐＢＴ和ｐＵＢＴ转化甘蔗, 相似文献
10.
甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备 总被引：12，自引：0，他引：12
根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的核苷酸序列合成引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得ＣＰ基因后,再将其克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）中。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,经ＩＰＴＧ诱导,ＣＰ基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得了高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了ＳＰＦＭＶ外壳蛋白的特异性抗血清。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和点免疫（Ｄｏｔｂｏ 相似文献
11.
在α-螺旋抗菌肽序列比较和两亲性分析的基础上,提取序列模板,计算机辅助（螺旋轮法）设计出新型抗菌肽模式肽PGYa(Peptide以Gly开头,以Tyr-NH2结尾),然后选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了PGYa基因（rPCR法）。所合成的基因全长为94bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型酵母表达载体pPICZα-A-PGYa。在AOX1 (醇氧化酶)启动子调控下,PGYa蛋白获得分泌表达,其表达量达到132 mg/L。初步抑菌（E.coli DH5α）活性显示：PGYa有较好的抗菌活性。 相似文献
12.
乙肝表面抗原和生长抑素融合基因在杆状病毒中表达 总被引：2，自引：0，他引：2
将乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）与生长抑素的融合基因（ＨＢｓＡｇ／ＳＳ）插入杆状病毒转移载体质粒ｐＶＬ１３９３，构成重组转移质粒ｐＶＬ１３９１ＨＳ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂质证实ＨＢｓＡｇ／ＳＳ已插入ＰＶＬ１３９３。借助磷酸钙沉淀法，将ＣｓＣｌ超速离心纯化的重组转移质粒和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）共转染Ｓｆ９细胞，用荧光空班和酶联免疫测定法（ＥＬＩＳＡ），筛选到重组病毒ＡｃＮＰＶＨＳ。提取感 相似文献
13.
传染性支气管炎病毒S1纤突糖蛋白基因的克隆及部分序列分析 总被引：4，自引：1，他引：3
大纤突Ｓ糖蛋白是传染性支气管炎病毒重要的免疫相关性蛋白之一，参考已发表的ＩＢＶ－Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因ＤＮＡ序列，合成一对特异性引物，以ＩＢＶ－ＲＮＡ为模板，应用ＲＴ－ＰＣＲ方法，获得传染性支气管炎病毒上海分离株Ｓ２Ｔ２－Ｓ１纤突糖蛋白基因，长度１．６５ｋｂ，利用引物设计中的ＢａｍＨ和ＨｉｎｄⅢ位点将其克隆到载体ｐＳＩ（＋）中。对该基因进行限制性酶发分析，结果与已报道的相一致。 相似文献
14.
无花果曲酶植酸酶基因phyA的克隆、序列分析及表达* 总被引：5，自引：0，他引：5
用RT-PCR方法从无花果曲酶(Aspergillus ficuum3．4322)中扩增出1条约1．4kb的特异性条带，并将其克隆到pMD18-T载体中。DNA序列测定表明，目的片段为不含信号肽的植酸酶编码序列，全长1347bp，编码448个氨基酸。该基因序列已在GenBank注册(注册号为：AF537344)。将该基因克隆到酵母表达载体pYES2中，构建成不带信号肽phyA基因的重组表达载体pYPA2。用醋酸锂法将pYPA2转进Ura缺陷型的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisine INVSc1)，筛选获得含植酸酶基因的酵母转化子。经半乳糖诱导表达后，用磷钼蓝显色(AMES)法对酵母菌体进行酶活性测定，测出了明显的植酸酶活性，pYPA2胞内植酸酶活性约11．55U／L，表明无花果曲酶phyA基因能在酿酒酵母中表达。 相似文献
15.
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系三大成员之一,被认为是纤维素糖化的限速酶。本研究克隆黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1),并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达分析。以GenBank上黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)序列为模板,设计特异性引物,从黑曲霉(Asperjillus niger)基因组DNA中扩增目的片段,通过SOE-PCR的方法将猪腮腺分泌蛋白信号肽序列sp和bgl1相连,成功构建分泌型真核表达载体pc6-sp-bgl1,利用脂质体介导法瞬时转染哺乳动物CHO细胞,通过RT-PCR和Western blot检测,最后通过DNS(dinitrosalicylic acid)法测定表达产物酶学活性。PCR扩增得到的目的序列与文献报道序列的相似性为91%,预测的蛋白氨基酸序列相似性为99%。RT-PCR和Western blot检测证明,外源基因bgl1在CHO细胞中得到表达;分泌到细胞培养上清中的重组蛋白对水杨素的水解活性为1.74U/mL,说明重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。本研究克隆得到黑曲霉bgl1基因并在哺乳动物CHO细胞中进行表达,为β-葡萄糖苷酶在单胃动物中的利用提供了基础研究资料。 相似文献
16.
大肠杆菌猪水肿毒素B亚单位基因的克隆与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已知大肠杆菌志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体Ｂ亚单位（ＳＬＴ－ＩＩｖＢ）基因序列,设计并合成３条２对引物,以大肠杆菌Ｏ１３８基因组为模板,通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）分别扩增出２０４ ｂｐ的基因序列及包含一段信号肽的２６１ ｂｐ基因序列。将这两段ＤＮＡ分别克隆进表达性载体质粒ＰＹＡ３３３４的ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ位点之间,经地高辛标记探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和酶切分析鉴定,并对两条扩增片段进行序列 相似文献
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刘锡娟 《农业生物技术学报》2007,15(6)
林敏教授课题组从具有草甘膦抗性的荧光假单胞菌G2中克隆了EPSP合酶基因aroAG2，根据aroAG2的氨基酸序列，按照双子叶植物偏爱密码子人工合成aroAG2M基因。我们利用aroAG2M基因和Impactvector1.4，构建了以菊花Rubisco启动子和叶绿体信号肽驱动aroAG2M基因高效表达的植物表达载体Pim1.4-epsps-plus，以农杆菌介导法转化烟草，转基因烟草经PCR和Southern检测，证明外源基因已整合到基因组中，转基因烟草具有草甘膦抗性。以花粉管通道法转化棉花，经草甘膦抗性筛选得到T1代转基因棉花3株，转基因棉花的PCR和Southern检测结果均为阳性，说明目的基因已通过花粉管通道法导入棉花。 相似文献
18.
拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。 相似文献
19.
油菜波里马胞质雄性不育相关线粒体基因orf224在大肠杆菌中… 总被引：8，自引：0，他引：8
本研究设计合成引物，从油菜波里马胞质雄性不育系线粒体ＤＮＡ上扩增出可能与育性有关的ｏｒｆ２２４基因５＇端（Ａ片段）和３＇端（Ｂ片段）以及全长基因（Ｃ片段）片段，并分段克隆到ｐＢＶ２２０和ｐＧＥＸ－５Ｘ－１载体上，经序列分析证实，获得了编码２２４个氨基酸基因的各序列片段。各重组菌株诱导表达产物比较分析表明，只有ｏｒｆ２２４ ３＇端即Ｂ片段融合蛋白ＧＳＴ－Ｂ得到了高效表达，其它菌株在聚丙烯酰胺凝胶电泳 相似文献
20.
以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。 相似文献