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从Bacillus sp.110-2基因组上分离得到的耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA),将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导得到表达.SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量大小为26.5 kD.对含有sodA基因工程菌的表达情况研究表明,重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶强的耐碱能力.BL21(pET-sodA)基因工程菌的构建提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,同时探索了一种极端酶的生产方法. 相似文献
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MabinlinⅡ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白，在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物。本文根据己知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆MabinlinⅡ基因，对基因进行剪切重组。将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a（＋）中，构建了3个重组表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌。经IPTG诱导，3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达。 相似文献
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重组鸡β-防御素5 - β-防御素10双分子蛋白的构建及其理化特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
鸡抗菌肽属禽β-防御素（AvBD）类,是鸡先天性免疫的重要组成部分。研究将AvBD10基因定向插入到AvBD5-pGEX SalⅠ和NotⅠ双酶切位点上,构建了AvBD5-pGEX- AvBD10双基因共表达重组载体。将重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli ) BL21,于37 ℃不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测外源基因的表达。结果表明,重组AvBD5-AvBD10双分子融合蛋白的分子量约为36 kD,重组双分子蛋白占菌体总蛋白的35%,重组菌表达产物以包涵体形式存在。重组双分子蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌[BL21(DE3-) 株]与致病性链球菌［Streptococcus（CAB株）］为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组双分子蛋白的抗菌活性,结果表明,重组双分子蛋白对这两种细菌都具有抗菌活性。并且对温度和pH有很高的稳定性,在-70～100 ℃或pH 3～12处理30 min仍具有抗菌活性。 相似文献
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大肠杆菌yqhD基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以大肠杆菌E scherich ia coli K-12基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到假定的氧化还原酶(pu tative ox idoreductase)基因yqhD,将它连接到克隆质粒pGEM-3zf(+)上,得到重组质粒pGEM-yqhD,对此重组质粒进行序列测定,对其DNA序列分析表明,yqhD基因全长为1 164 bp。再将yqhD基因插入表达载体pSE 380,构建成重组子pSE 380-yqhD,并在E.coli BL 21中获得表达。研究表明,以1,3-丙二醇为底物时,基因工程菌在30°C下,以1.0 mm o l/L IPTG诱导12 h的酶活力达到3.13 U/mL,比对照菌株提高4.4倍。 相似文献
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为实现人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度（16℃）有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。 相似文献
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甲状腺激素应答基因（thyroidhormone responsive SPOT14,THRSP）是受甲状腺激素诱导表达的核内基因,参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控,对动物脂肪生成具有重要的调控作用。为进一步研究猪SPOT14基因所编码蛋白质的生物学功能,本实验将猪SPOT14（GenBank登录号:JF951726）的ORF片段与表达载体pET-28α（+）进行重组,获得的重组子pET-28α（+）-S14,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL2l（DE3）感受态细胞,重组菌经IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析显示,目的蛋白分子量约为20.91kD,且主要以包涵体形式存在,最佳诱导条件是37℃1mmol/LIPTG诱导5h。将获得的包涵体用6xHisNi-NTA纯化柱纯化后,采用Western blot进一步检测到了21kD目的蛋白的表达。重组质粒pET-28α（+）-S14在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地得到了表达,不仅为SPOT14基因生物学功能的研究,而且为进一步研究S14蛋白功能,了解脂肪代谢调控机制提供了基础资料。 相似文献
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猪链球菌2型纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白
全基因的克隆及融合表达 总被引：4，自引：0，他引：4
采用发表的引物对,以猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）江苏分离株HA9801的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白基因fbps（GenBank登录号为AY565303）克隆于pMD-T18载体构建成载体pMD-T-fbps.经内切酶酶切和测序鉴定后,将由pMD-T-fbps内切酶切下的片段定向克隆于表达载体pET-32a（＋）,得到重组质粒pfbps.将重组质粒pfbps转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21株,经IPTG诱导,可高水平地表达相对分子量为83 kD的融合蛋白.配体印迹结合试验表明,表达的融合蛋白可与人纤连蛋白结合. 相似文献
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以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主，重组表达亚油酸异构酶(gLI)。根据GenBank上发表的gLI基因序列，设计并合成一对引物，从L.reuteriPYR8基因组中，PCR扩增出去除5’端42bp信号肽的gLI基因片断，将其克隆入pMD－18－T载体中，序列测定后将gLI基因亚克隆到表达载体pET30a中（pET30a-gLI），将其转化大肠杆菌BL21(DE3)， 在1mmol/L IPTG 30℃条件下诱导表达，大肠杆菌裂解物经SDS-PAGE分析，出现了一新分子量约67kD的蛋白带，与预期目的蛋白分子量相符。生物学活性鉴定表明：经稀释、透析复性，获得的重组gLI在反应缓冲液可以将亚油酸（LA）转化为共轭亚油酸（CLA），30℃ pH7.3的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，酶活最高为1377U。为进一步体外研究gLI的生物学活性、酶作用机制奠定了基础。 相似文献
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根据猪圆环病毒2型（PCV2）LC株序列,设计合成3对引物,通过PCR扩增PCV2的3个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到pET-32a载体中,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,表达并纯化了重组蛋白。Western-blot分析表明,重组蛋白可以与PCV2阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白初步建立了间接酶联免疫吸附实验（ELISA）方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为0．24μg／mL,血清最佳的稀释度为1：40。 相似文献
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花青素合成酶（ANS）是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花（Rhododendron hybridum Hort.）ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录（RT-PCR）和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱（Waters UPLC-Qtof）技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体（pET-28a）上,并在大肠杆菌（BL21）中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱（HPLC）检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1 350 bp,开放阅读框（ORF）序列1 074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官（... 相似文献
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本论文通过PCR的方法从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv. glycinea)ICMP2189中克隆到了乙烯合成酶基因efe，并且在大肠杆菌BL21（DE3）中利用T7强启动子进行了高效表达，表达蛋白占总蛋白的45%。气相色谱分析表明含有efe基因的大肠杆菌可以高效的产生乙烯。研究结果为生物乙烯的研究和应用奠定了基础。 相似文献
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为探讨RANKL以及OPG/RANKL/RANK通路在笼养蛋鸡骨质疏松发生中的作用,进行鸡破骨细胞分化因RANKL（receptor activator of NF-κB ligand）的克隆、表达并鉴定其活性。以成骨细胞总RNA为模板,利用RT-PCR和SOE-PCR技术体外扩增RANKL 基因,将PCR产物克隆至组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-32a(+),在异丙基－β－D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下,实现了chRANKL的有效表达,表达产物纯化后稀释成不同浓度梯度作用成熟破骨细胞观察其生物学活性。结果表明,凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为1200 bp左右,插入片段与Genebank上报道的鸡RANKL序列完全一致。重组表达载体转化BL21后经IPTG诱导获得大小约为64 Kd的重组蛋白,Western印迹表明重组蛋白具有抗原活性;并且纯化后的蛋白能刺激成熟破骨细胞,使骨吸收指数呈剂量依赖性增加,表明具有一定的活性。 相似文献
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家蚕真核细胞翻译起始因子(BmeIF4E)基因的克隆、表达及功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究从自建的家蚕(Bombyx mori)蛹期cDNA文库中筛选到一条cDNA序列,发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子钮基因(BmeIF4E)具有较高的相似性,推测可能是家蚕eIF4E基因,将该序列命名为BmeIF4E,GenBank登录号为DN443192.为研究BmeIF4E的生物学功能,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E,转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白,制备多克隆抗体.利用家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明,BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中.荧光定量PCR和Westem blot分析结果表明,在不同组织及发育时期该基因的表达有差异,在各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺;在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量较低.以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA,脂质体法转染Bm5细胞,72 h后提取细胞总蛋白作Western blot检测RNA干扰情况,发现BmeIF4E基因被干扰后,总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组.MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降.研究结果提示,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均有表达,起着十分重要的作用. 相似文献
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应用自动诱导表达体系提高原核表达效率 总被引：1，自引：0，他引：1
自动诱导表达体系是依据T7表达菌株对于培养基中的碳源和能源的利用机制建立起来的,用于生产各种异源蛋白更加高效、便捷和经济。为提高重组蛋白在原核细胞中的表达效率,构建了以S基因抗原位点区作为目的基因的原核表达重组质粒pET-S1,并将其转化入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）菌株。用IPTG诱导表达系统和自动诱导表达系统分别对目的蛋白进行表达。结果表明,目的蛋白最高表达量分别占菌体总蛋白的25.9 %和45.1 %,表明自动诱导表达系统可明显提高表达效率。 相似文献
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手掌参中赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因的表达、纯化及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
目的: 构建含赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因(gcgasa)的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达。材料：手掌参。方法：设计带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物,分别对gcgasa基因编码区全长及信号肽缺失的片段进行PCR扩增,将目标片段克隆入原核表达载体pET-32(a),构建重组质粒。经测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并采用SDS-PAGE、Western-blotting、电镜超薄切片技术检测外源蛋白的表达及定位情况。对于水溶性蛋白,采用Ni2+-NTA亲和层析及凝胶过滤手段纯化。结果: 含有信号肽的外源基因在大肠杆菌周质空间中以包含体形式存在,而信号肽缺失的片段主要以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化可获得目的蛋白。结论：首次在原核表达系统中高效表达了水溶性的gcgasa蛋白,为其结构和功能的研究奠定了基础。 相似文献
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参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。 相似文献
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本试验选用两种翻译起始区不同的表达载体pET28a(+)、pGEX-KG和两种对稀有密码子效应不同的表达宿主菌BL21(DE3)、Rossetta(DE3),构建出四种重组表达菌（pET-fasG BL21(DE3), pET-fasG Rossetta(DE3), pKG-fasG BL21(DE3)和pKG-fasG Rossetta(DE3)）来考查翻译起始区的二级结构和稀有密码子对fasG基因表达的影响。对重组表达菌进行诱导表达的结果表明,翻译起始区的二级结构和稀有密码子的存在都能影响到目的基因的表达,通过优化翻译起始区的二级结构或优化稀有密码子都能提高目的蛋白的表达量。由于pKG-fasG优化了mRNA翻译起始区的二级结构,同时Rossetta(DE3)缓解了稀有密码子对目的蛋白表达的影响,pKG-fasG Rossetta(DE3)目的蛋白的表达量达到16%,较pET-fasG BL21(DE3)的表达量（8%）提高了100%。试验结果表明,对外源基因的表达,选择合适的表达载体和宿主菌,对获得较高的表达量是非常重要的。 相似文献
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拟南芥alpha-Dioxygenase 2原核表达，纯化及亚细胞定位预测 总被引：2，自引：0，他引：2
alpha-Dioxygenase 2推测可以催化脂肪酸alpha氧化，参与植物的发育过程。从ABRC（Arabidopsis Biological Research Center）获得alpha-Dioxygenase 2基因cDNA，用带有SmaI和XhoI酶切位点的引物扩增编码区，连入pMD-T simple vector,测序无误后，双酶切将DOX2构建于原核表达载体pGEX-5X-1中，转化表达菌株BL21 (DE3) pLysS和BL21 (DE3)-RIPL codon + ,SDS-PAGE和Western Blot结果表明该基因在BL21 (DE3)-RIPL codon +表达菌株中得到了高效表达，可溶性分析表明大部分目的蛋白以包涵体形式存在，通过GST亲和柱纯化得到可溶性目的蛋白，供下一步活性分析之用。生物信息学分析表明：该基因读码框密码子中88个为E.coli的稀有密码子，占总密码子的14%。支持向量机算法对DOX2进行的亚细胞定位预测分析提示：该酶可能定位在细胞质中。 相似文献