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1.
为了获得适于龙珠果ISSR-PCR的反应体系,本研究以龙珠果叶片为试验材料,提取基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响龙珠果ISSR-PCR扩增结果的Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA量进行优化,并筛选了最适退火温度。试验结果分析表明,各因素影响显著性为dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶用量>Mg2+浓度>模板DNA量>引物浓度。在20μL反应体系中,dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度2.0 mmol/L、模板DNA 25 ng、引物浓度0.4μmol/L为最佳用量。实验从100条UBC引物中筛选得到22条多态性较好的引物。本研究为龙珠果ISSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。 相似文献
2.
为了建立金莲花ISSR-PCR最佳反应体系,本研究以内蒙古自治区境内野生金莲花为试验材料,采用L16(45)正交实验设计,对影响ISSR-PCR扩增结果的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、Mg2+、引物5个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化。结果显示,每个因素都具有极显著差异,影响最大的为dNTPs,其余依次为Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物,影响最小的为Mg2+浓度。最佳反应体系为:DNA模板30 ng,引物0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶0.075 U/20μL,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg2+1.0 mmol/L,反应总体积20μL。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火1 min,72℃延伸100 s,最后72℃延伸7 min,共38个循环,4℃保存。采用优化后的体系对金莲花不同居群进行验证,证明优化后体系扩增出明亮清晰的条带且重复性好,可用于后续金莲花遗传多样性分析。 相似文献
3.
草莓SRAP反应体系优化及引物筛选 总被引：1，自引：1，他引：0
为建立草莓SRAP-PCR适宜的反应体系,以草莓品种‘丰香’为实验材料,采用单因素实验设计,对Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物浓度4个因素4水平进行优化,并在此基础上对模板DNA的浓度和退火温度进行优化。结果表明,草莓SRAP-PCR最佳反应体系为：20μL的反应体系中含10×PCR buffer 2μL,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,正反向引物各为0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为100 ng。扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。利用该优化体系筛选引物,从110对SRAP引物组合中筛选出29对条带清晰丰富、多态性好的引物,证明了此优化体系稳定可靠,能够用于草莓种质资源的鉴定、分子标记辅助育种等研究。 相似文献
4.
为了建立和完善旱半夏的ISSR-PCR反应体系,本研究以四川地区野生旱半夏为试验材料。以旱半夏整株的基因组DNA为模板,初筛的UBC818号引物用于ISSR-PCR体系,采用正交实验L16(45)并结合单因素实验方法对体系进行优化。通过正交试验结果直观评分可知各因素对该实验结果的影响强度从高到低依次为:d NTPs,引物,Mg2+,Taq DNA聚合酶,DNA模板;单因素实验结果表明,最优的20μL反应体系为:d NTPs 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.075 U/μL,DNA模板15 ng,退火温度为56℃。本研究通过优化ISSR-PCR反应体系,此体系将应用于半夏组培苗遗传稳定性的检测。 相似文献
5.
为建立蓝莓SCoT标记分析体系,为蓝莓的分子育种和遗传多样性分析等研究提供技术支持,以蓝莓叶片为试材,采用L16(45)正交设计方法,对影响蓝莓SCoT-PCR反应的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA及引物等因素进行优化筛选,建立了适用于蓝莓遗传分析的SCoT-PCR扩增体系,即20μL的反应体系中含有：Mg2+为2.813 mmol/L、dNTPs为0.100 mmol/L、Taq酶为1.5 U、Primer为0.2μmol/L、DNA为10 ng。应用优化的反应体系,对32个SCoT引物和6个蓝莓品种‘( Centurion’、‘Premier’、‘Homebell’、‘O'Neal’、‘Tifblue’、‘Misty’)进行扩增,获得了条带清晰、稳定可靠的电泳结果。 相似文献
6.
刺槐EST-SSR标记PCR反应体系的优化 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立一套适用于刺槐EST-SSR标记的PCR反应体系,采用L16(45)正交试验设计结合单因素试验,对刺槐EST-SSR PCR反应体系中的5个主要因素：引物、DNA模板、dNTPs、Mg2+和Taq DNA聚合酶进行优化试验。结果表明：在20μL反应体系中,各反应因素的最佳水平为0.5μmol/L引物、30 ng模板DNA、0.15 mmol/L dNTP、0.5 mmol/L Mg2+、1.0 U Taq DNA聚合酶。利用随机挑选的3个刺槐优良无性系品种和7对EST-SSR引物对优化体系进行验证,结果均能获得稳定、清晰的条带,证明该体系稳定可靠。此优化体系的建立为刺槐EST-SSR标记的开发以及利用EST-SSR标记深入研究和利用中国刺槐种质资源奠定基础。 相似文献
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油葵SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选 总被引：3，自引：1，他引：2
为了获得适合油葵的SSR-PCR反应体系,通过采用控制变量法对影响SSR反应体系的主要因素进行优化,研究Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等因素。结果表明各因素的终浓度分别在Mg2+浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq酶量0.5 U、引物浓度0.4 μmol/L及退火温度为53.9℃时最为适合。通过试验优化后的体系筛选引物,最终从50对引物筛得19对多态性好的引物可进行下一步的研究。 相似文献
8.
《分子植物育种》2017,(4)
本研究以榴莲蜜(Artocarpus integer(Thunb.)Merr.)品种‘多异1号’嫩叶为试材,通过比较5种CTAB法,提取到高质量的榴莲蜜基因组DNA,利用正交设计L25(56)探究了Mg~(2+)、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物及模板DNA用量对榴莲蜜SCoT-PCR反应的影响,在此基础上对退火温度进行了优化,建立了SCoT反应体系。结果表明:使用含有4%β-巯基乙醇和12.5 mmol/L硼砂的2%CTAB提取缓冲液,两次抽提后用1/2体积无水乙醇和与上清等体积的4 mol/L LiCl沉淀RNA,能够提取到高质量的基因组DNA;优化后的20μL榴莲蜜SCoT-PCR反应体系含有Mg~(2+) 2 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、引物0.375 mol/L、模板DNA 10 ng,最适退火温度48.2℃。该体系可以为榴莲蜜遗传多样性分析、基因定位等提供技术支持。 相似文献
9.
广东紫珠ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选 总被引：2，自引：2，他引：0
为建立稳定性、重复性好的广东紫珠ISSR-PCR反应体系,以广东紫珠总DNA为试验材料,通过单因子结合正交试验对模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度和Taq酶用量进行优化,确立了适用于广东紫珠的最佳ISSR-PCR反应体系：0.25 mmol/LdNTPs、1.00 U Taq DNA聚合酶、0.75μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、100 ng模板DNA,总反应体积为25μL。同时建立重复性和稳定性均较好的ISSR-PCR扩增程序：预变性94℃,5 min;变性94℃,30 s;退火温度与每个引物相对应,退火45 s;72℃延伸90 s;34个循环;后72℃延伸10 min;4℃保存,扩增结束。用来自不同居群4个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的20个引物。 相似文献
10.
甜菜SCoT-PCR反应体系的建立及优化 总被引：2，自引：2，他引：0
旨在利用SCoT分子标记技术为甜菜指纹图谱构建、遗传多样性分析以及其他分子标记辅助育种提供技术支持。本研究利用单因素实验优化了甜菜SCoT-PCR反应体系。结果表明,在20 μL反应体系中,甜菜SCoT-PCR最优反应体系包含2.0 μL的10×PCR buffer（含Mg2 ）、10 ng的DNA、0.5 U的Taq DNA聚合酶、10 μmol/L的引物2 μL以及0.1 μL的dNTPs (2.5 mmol/L each)。利用优化后的程序对12份糖甜菜品种进行扩增,结果表明,该体系扩增结果稳定、条带清晰,可用于甜菜品种指纹图谱的构建以及其他分子生物学领域的研究。 相似文献
11.
为建立适合新疆野生欧洲李的ISSR-PCR反应体系,本研究以野生欧洲李为供试材料,采用L16(45)正交试验设计和单因素试验设计相结合的方法,对影响野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的5个因素(DNA模板,Taq酶,dNTPs,引物,Mg2+)进行筛选与优化,对16条引物的退火温度进行筛选。结果表明,Taq酶对PCR扩增反应的影响最大,野生欧洲李ISSR-PCR最佳反应体系为:总体积20μL,5 U Taq酶0.10μL,10 mmol/L引物1.00μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.50μL,10×Buffer(含Mg2+)2.00μL,50 ng/μL DNA模板1.00μL,双蒸水14.40μL。建立的ISSR-PCR反应体系经过22份野生欧洲李样品验证,表明反应体系稳定可靠,可用于后续遗传多样性研究,为野生欧洲李种质资源的保护和利用提供理论参考。 相似文献
12.
苦瓜基因组DNA的提取及ISSR扩增体系的优化 总被引：2，自引：1，他引：1
为了快速获取高质量的苦瓜基因组DNA,以便进行苦瓜白粉病抗性基因分子标记研究,比较了不同的DNA提取方法、不同部位的苦瓜叶片提取基因组DNA的产量和质量,探究了苦瓜基因组DNA提取的最佳方法和叶片的最适部位;研究了ISSR-PCR的退火温度,并采用正交设计法对影响ISSR-PCR的Mg2+、dNTPs、Taq酶、模板DNA以及引物浓度等5个因素进行了优化。结果表明,采用改良CTAB法从苦瓜顶端嫩叶中提取的基因组DNA OD260/OD280值在1.8~1.9之间,OD260/OD230值为2.0左右,对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测,主带清晰,降解较少,产量和纯度均较高,效果较好。优化后的ISSR-PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl2,250μmol/L dNTPs,10 ng模板DNA,0.75 U Taq酶,引物浓度0.7μmol/L,反应总体积为25μL,引物UBC826最佳退火温度为53℃。该体系在多次重复中均能获得良好的扩增结果。苦瓜基因组DNA提取的最佳方法为改良CTAB法,最适合的部位为顶端嫩叶。 相似文献
13.
绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。 相似文献
14.
正交设计优化狭叶坡垒ISSR-PCR反应体系 总被引：1，自引：1，他引：0
以狭叶坡垒DNA为模板,利用正交试验分别对ISSR-PCR反应的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最佳退火温度和循环次数,最终确定狭叶坡垒最佳反应体系及扩增条件为：25 μL体系中1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,0.04 U/μL Taq聚合酶,0.2 μmol/L引物,4 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃最后延伸7 min。 相似文献
15.
花椰菜的ISSR-PCR反应体系的建立与优化 总被引：2，自引：1，他引：1
以花椰菜基因组为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合花椰菜的ISSR-PCR反应体系:25μL反应体积:内含10×PCR反应缓冲液(含Mg~(2+))2.5μL、0.5U TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物、60ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为48.6℃。扩增程序为94℃预变性5 min;然后94℃变性30s,46.9℃退火45 s,65℃延伸1.5min,35个循环;最后65℃延伸7min,4℃保存。用120条引物对花椰菜基因组进行标记,筛选出引物TI-13可以将这6份花椰菜材料区分开。花椰菜ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行花椰菜品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。 相似文献