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黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达 总被引：2，自引：0，他引：2
通过RT-PCR方法,以黑曲霉(Aspergillus niger)GIM3.452总RNA为模板,克隆出木聚糖酶B(xy-lanase B,xynB)基因的成熟肽编码序列(567 bp),编码188个氨基酸.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretoryprotein,PSP)基因的信号肽序列通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段PSxynB,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSxynB,重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且构建正确.在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-PSxynB转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中测到了木聚糖酶活最高达36.4 IU/mL. 相似文献
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为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。 相似文献
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采用链酶蛋白酶消化法获得猪成肌细胞、肌细胞生成素(MyoG)和生肌决定因子(MyoD)的RT-PCR和Desmin免疫组化染色鉴定猪成肌细胞后,分别研究外源Leptin对猪成肌细胞产热相关基因过氧化体增殖活化受体gamma辅助活化因子α(PGC-1α)和解偶联蛋白家族(UCPs)mRNA表达的影响。对产热相关基因的RT-PCR检测结果表明,30和100nmol/L Leptin均可促进成肌细胞中PGC-1α mRNA表达,100 nmol/L Leptin作用效果显著高于30 nmol/L,且作用24h促进效果明显优于12h作用效果(P<0.05)。30 nmol/L Leptin可明显提高成肌细胞中UCP2 mRNA的表达,且作用24h促进效果明显优于12h处理效果(P<0.05),100 nmol/L Leptin作用效果显著低于30n mol/L Leptin作用效果,但显著高于对照组(P<0.05)。30和100 nmol/L Leptin均不影响UCP3 mRNA的表达(P<0.05)。结果提示,Leptin可能通过上调PGC-1α和UCP2转录,促进成肌细胞能量消耗。 相似文献
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猪(Sus scrofa)对饲料中植酸磷的消化利用效率很低,其粪便中排放大量未吸收的磷,对环境产生严重污染,在猪唾液腺中表达分泌植酸酶是解决猪粪磷污染的一条新途径.为了制备唾液腺特异表达植酸酶的新型减磷排放转基因猪,本研究构建了一条由猪腮腺分泌蛋白基因(parotid secretory protein,PSP)启动细菌源植酸酶基因appA(acid phosphoanhydride phosphohydrolase)表达的转基因载体,并利用体细胞核移植技术获得14头原代(F0)转基因克隆猪,经PCR鉴定,其中8头为阳性猪.PCR分析显示,appA基因在转基因猪的唾液腺组织特异表达,但在肾脏、肝脏、心脏、十二指肠等组织中不表达.营养代谢分析证明,转基因猪粪磷排放量比非转基因猪显著减少了16％(P＜0.05),而转基因猪对干物质和能量的表观消化率以及对Ca、P的消化率均高于野生型猪,但未达到显著水平.外源基因从F0转基因猪稳定遗传至F1,并且Southern blot分析显示,外源基因是以单拷贝形式整合至转基因猪基因组.F1转基因猪的appA表达模式与F0转基因猪相似,其只在唾液腺中特异表达,且以颌下腺表达最高,其次是腮腺和舌下腺,在肾脏、心脏、肝脏等组织不表达.本研究成功获得唾液腺特异表达植酸酶转基因猪,为培育新型减磷排放的环保转基因猪新品种提供了科学依据. 相似文献
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为了获得有特色的观赏鱼,本实验室在2003年将含有海葵红色荧光蛋白基因的表达载体(同时含有标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ))转入唐鱼(Tanichthys albonubes)的受精卯,获得转红色荧光蛋白基因唐鱼,对其外源标记基因NPTⅡ的表达产物和存在时间进行分析,为评价转基因鱼的生物安全提供依据.本实验对转基因唐鱼和非转基因唐鱼肌肉中抗生素标记基因(NPTⅡ)进行PCR检测和NPTⅡ表达产物的免疫检测试剂条检测,结果显示,转基因唐鱼检测到NPTⅡ基因和表达产物,而非转基因唐鱼中均没检测到该基因和表达产物存在.同时在唐鱼死亡后(水温20～25℃),应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)对死亡0 (鲜活肌肉)、24、48、72、96、120和144 h组的转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白的含量进行定量检测,结果表明,转基因唐鱼鲜活肌肉中NPTⅡ蛋白在肌肉中的含量为9.12 ng/g,随着转基因唐鱼死亡时间增加肌肉中NPTⅡ蛋白含量逐渐减少,死亡96 h组转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白已经接近为0.结果表明,转基因唐鱼肌肉中NPTⅡ蛋白在白然环境中容易降解,推测其对环境安全隐患相对较低. 相似文献
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酰基辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶(acyl-coA:diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是催化甘油三酯合成最后一步反应的关键酶,包括DGAT1和DGAT2两种;阐明其在发育过程中的表达规律对于找到控制中外猪种脂肪沉积能力差异的基因十分必要.本研究分别用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR的方法分别对莱芜猪和杜洛克3日龄仔猪和成年猪背膘组织中DGAT1和DGAT2 mRNA表达量进行了分析.结果表明,莱芜猪和杜洛克成年猪DGAT1 mRNA的表达量均高于3日龄仔猪,分别为5.0倍和2.7倍;成年猪DGAT2 mRNA表达量高于3日龄仔猪,分别为27.6倍(P＜0.01)和4.8倍(P＜0.05).两品种成年猪和3日龄仔猪DGAT2基因表达量的变化均高于DGAT1.品种间同一发育时期比较,杜洛克3日龄仔猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于莱芜猪,但成年莱芜猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于杜洛克,差异均不显著(P＞0.05).提示DGAT2基因可能与中外猪品种脂肪沉积能力的差异有关. 相似文献
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刘永刚;熊远著;左波;蒋思文;邓昌彦;李家连;李凤娥;郑嵘 《农业生物技术学报》2006,14(3):323-328
为了揭示猪杂种优势的分子机理，利用mRNA差异显示技术研究梅山猪，大白猪和梅大杂交猪背最长肌中基因表达的差异, 分离14条在杂种与纯种背最长肌中差异表达的表达序列标签(EST), 并用半定量RT-PCR鉴定。核苷酸序列分析表明, 这14个EST与已知的基因或表达序列标签没有明显的同源性，随后这14条EST 被提交到GenBank数据库。组织表达谱分析揭示了这些EST在心、脾、 肝、肾 、 小肠、 卵巢、 肺等绝大多数组织中表达, 说明这些基因对生命过程很重要。这些研究结果表明梅山×大白杂交组合的杂种与纯种之间的不同基因差异表达的方向存在巨大差异，猪杂种优势可能是在一定阶段有诸多不同的必不可少的基因向各种方向差异表达共同作用的结果。 相似文献
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多胺是一类广泛分布于组织细胞内的天然低分子多价生物活性物质,在动物的消化、营养代谢以及正常生长中发挥重要作用。本实验克隆了猪(Susscrofa)的7个与多胺代谢相关的基因,分别是精氨酸脱羧酶(ADC)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、鸟氨酸转氨酶(OAT)、鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白1~3(OAZ1、OAZ2、OAZ3)及多按调控因子-1(PMF1),基因片段长度分别是1602(GenBank No.EU545649)、1422(GenBank No.EU534186)、1465(GenBank No.EU404089)、874(GenBank No.EU545195)、678(GenBank No.EU545196)、667(GenBank No.EU545197)及703bp(GenBankNo.EU534185),开放阅读框的长度分别是1380、1383、1313、681、568、559和615bp,编码的氨基酸数目分别是460、461、439、227、189、186和205。经过比对分析,猪ADC基因编码的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为89.7%和87%;猪ODC与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和大鼠(Rattus norvegicus)的同源性分别为93.1%、89.8%和90.5%;猪OAT与人、小鼠的同源性分别为91.8%、90.5%和89.8%;猪OAZ1与人、大鼠及小鼠的同源性分别为93.4%、82.5%和83.8%;猪OAZ2与人、大鼠及小鼠的同源性分别为99.5%、98.9%和98.9%;猪OAZ3与人、小鼠和大鼠的同源性分别为90.4%、87.5%和84.2%;猪PMF1基因编码的氨基酸序列与人和小鼠的同源性为84%和70.9%。半定量RT-PCR分析表明,断乳后ADCmRNA的表达量在盲肠和直肠有所增加,其他各组织均有所降低;ODCmRNA的表达量在直肠和盲肠有较大增加,结肠、回肠和空肠的表达量均呈小幅降低;OATmRNA在肾的表达量有明显增加,十二指肠、空肠和回肠都有降低;除了胃,OAZ1mRNA在其他组织表达水平均有所增加;OAZ2mRNA的表达量在所有组织均有不同程度增加,盲肠居首;OAZ3mRNA在肠道组织的表达量均有不同程度增加;PMF1mRNA的表达量在结肠、空肠和回肠与抗酶家族相似,但断乳后有小幅降低。研究结果提示,多胺对仔猪的生长、发育、成熟、适应性和损伤后的恢复具有重要的生物学作用。 相似文献
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梅山猪、大白猪和梅大杂交猪背最长肌中差异表达的14个表达序列标签的分离、鉴定及组织表达分析 总被引：2，自引：1，他引：2
为了揭示猪杂种优势的分子机理,利用mRNA差异显示技术研究梅山猪,大白猪和梅大杂交猪背最长肌中基因表达的差异,分离14条在杂种与纯种背最长肌中差异表达的表达序列标签(EST),并用半定量RT-PCR鉴定.核苷酸序列分析表明,这14个EST与已知的基因或表达序列标签没有明显的同源性,随后这14条EST被提交到GenBank数据库.组织表达谱分析揭示了这些EST在心、脾、肝、肾、小肠、卵巢、肺等绝大多数组织中表达,说明这些基因对生命过程很重要.这些研究结果表明梅山×大白杂交组合的杂种与纯种之间的不同基因差异表达的方向存在巨大差异,猪杂种优势可能是在一定阶段有诸多不同的必不可少的基因向各种方向差异表达共同作用的结果. 相似文献
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Wnt3a是经典Wnt通路上游的一个重要分泌蛋白,Wnt3a蛋白的活化可促进多种细胞的增殖和分裂。为了揭示Wnt3a在猪胰腺干细胞(PSC)增殖及分化中的调控机理,采用RT-PCR从pGKS2P(+)-Wnt3a质粒中扩增出Wnt3a全长片段,将测序正确的Wnt3a连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP1)报告基因的真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,构建重组质粒。经EcoRⅠ/BamHⅠ酶切鉴定后,用脂质体转染至猪PSC。用抗生素G418筛选3周后获得稳转pIRES2-AcGFP1-Wnt3a的细胞株。荧光显微镜下观察到几乎所有细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR和Western blot的结果显示,稳转Wnt3a组的猪PSC中Wnt3a mRNA及蛋白表达水平比对照组明显升高。这些结果表明,稳定表达Wnt3a的猪胰腺干细胞株成功建立,为进一步研究Wnt3a在猪PSC增殖及分化中的作用机理提供了基础资料。 相似文献
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采用酵母偏爱密码子合成5条编码猪胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因的引物,利用重叠PCR技术获得含210bp猪IGF-Ⅰ成熟蛋白基因的拼接产物。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中,转化巴斯德毕赤酵母菌(Pischia pastoris)。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌,以1.5%甲醇诱导培养后,经SDS-PAGE检测表达产物,在7.5kD处出现一特异蛋白条带,目的蛋白表达量达410mg/L。Dot blot检测表明,重组蛋白可与抗IGF-Ⅰ多克隆抗体反应。 相似文献
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金属硫蛋白-1基因(metallothionein-1,MT-1)是一类广泛存在于动物体内的金属结合蛋白,除维持金属动态平衡和重金属解毒外,还可参与清除自由基、拮抗电离辐射和抗应激等。为深入研究MT-1基因参与动物机体抗逆性的分子机制,本研究采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛(Bos grunneins)MT-1基因全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析MT-1蛋白的理化性质、结构和不同物种间的同源性,并利用RT-qPCR方法分析MT-1基因在天祝白牦牛各个脏器和组织中的表达丰度。结果表明,天祝白牦牛MT-1基因cDNA序列全长为408 bp(GenBank登录号:KF770836),开放阅读框(ORF)长186 bp,编码61个氨基酸,氨基酸的分子量为5.981 kD;氨基酸序列分析显示,天祝白牦牛MT-1基因编码氨基酸序列与牛(Bos taurus)的同源性高达100%,同时与大多数哺乳动物相似;荧光定量PCR结果发现,MT-1 mRNA在天祝白牦牛8个不同脏器和组织中均有表达,心脏中表达量最高。天祝白牦牛MT-1基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能提供了基础资料。 相似文献
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灯盏花乙素(scutellarin,Scu)具有清热解毒、扩张心脑血管、改善微循环等作用。通过观察不同浓度Scu对猪肾小管上皮细胞(pig kidney proximal tubular,LLC-PK1)热休克蛋白72(heat shock protein72,HSP72)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cellymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)表达的影响,探讨灯盏花乙素提高细胞耐热性的可能机制。将培养的LLC-PK1细胞随机分为37℃空白对照(Ⅰ组),42℃单纯热应激1 h(Ⅱ组),以及分别用不同浓度(1×10-5、1×10-6和1×10-7mol/L)Scu处理并42℃热应激1 h组(分别为Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组),提取各组细胞总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP72、Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达量。结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组LLC-PK1细胞HSP72和Bax的mRNA及蛋白表达量显著升高(P0.05),Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值显著降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达量并无显著差异(P0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅳ和Ⅴ组LLCPK1细胞HSP72 mRNA和蛋白的表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ组无显著差异(P0.05);Ⅳ组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ和Ⅳ组并无显著差异(P0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组Bax mRNA和蛋白表达量均显著降低(P0.05);Ⅳ和Ⅴ组Bcl-2/Bax蛋白比值显著升高(P0.05)。研究结果表明,热应激条件下Scu可诱导LLC-PK1细胞HSP72表达,提高Bcl-2/Bax比值。结果提示,Scu可增强细胞的抗热休克作用。本研究丰富了体外培养细胞热应激反应的理论,为在实践中增加细胞抗热休克能力提供了理论依据。 相似文献
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摘要：本实验采用链酶蛋白酶消化法获得猪成肌细胞， MyoG和MyoD的RT-PCR和Desmin免疫组化染色鉴定猪成肌卫星细胞后，分别研究外源leptin对猪成肌细胞产热相关基因PGC-1α和 UCPs mRNA表达的影响。对产热相关基因的RT-PCR检测结果表明，30 nmol/L 和100nmol/LLeptin均可促进成肌细胞中PGC－1αmRNA表达，100nmol/L Leptin作用效果显著高于30 nmol/L，且作用24h促进效果明显优于12h作用效果(p<0.05)。30nmol/LLeptin可明显提高成肌细胞中UCP2mRNA的表达，且作用24h促进效果明显优于12h处理效果(p<0.05)， 100nmol/L leptin作用效果显著低于30nmol/L Leptin作用效果，但显著高于对照组(p<0.05)。30 nmol/L 和100nmol/L leptin均不影响 UCP3mRNA的表达(p<0.05)。以上研究结果提示，Leptin可能通过上调PGC-1α和UCP2转录，促进成肌细胞能量消耗。 相似文献
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小麦种间与品种间杂交种及其亲本之间基因差异表达比较研究 总被引：8，自引：0，他引：8
选用小麦种间强优势杂交种3338×Di7(杂种Ⅰ)、品种间强优势杂交种3338×6554(杂种Ⅱ)和无优势杂交种2410TD×6554(杂种Ⅲ)及其亲本斯卑尔脱小麦Di7、普通小麦品种(系)3338、2410TD和6554,采用mRNA差异显示技术分析了杂种和亲本苗期叶片的基因表达差异,以加深对小麦杂种优势形成的分子机理的认识.结果表明小麦杂交种与其亲本之间在基因表达上均存在明显差异,表现为数量水平和质量水平上的差异,且差异表达类型丰富.分析发现,强优势杂种Ⅰ和杂种Ⅱ与其双亲间展示出的差异表达条带数目基本相同,但在差异表达类型上存在明显差异,特别是种间杂种Ⅰ中存在较高比例的单亲表达一致型和偏高亲型基因,说明种间杂交种中亲本基因的表达变化方式与品种间杂交种有所不同.研究还发现,与弱优势杂种Ⅲ相比,在强优势杂种Ⅰ和杂种Ⅱ中,增强型、杂种特异表达型及单亲表达增强型比例较高,与以前的研究结果(Euphytica,1999,117～123)一致,表明杂种特异表达或增强表达基因可能与小麦杂种优势形成有重要关系. 相似文献
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卵母细胞成熟和母源型-合子型过渡过程中,存在大量基因的表达差异,使得应用mRNA差异显示(DDRT-PCR)筛选对胚胎发育起关键作用的基因成为可能。为了解牛卵母细胞成熟过程及体外受精胚胎不同发育阶段相关基因mRNA表达规律,本研究以牛生发泡(GV)期卵母细胞、体外受精获得的8细胞期胚胎和囊胚期胚胎为检测对象,利用mRNA差异显示技术筛选这三个时期mRNA表达差异基因,并用实时定量PCR分析差异基因在这三个时期以及体外成熟卵母细胞中的mRNA丰度。结果成功筛选得到5个差异片段,经测序和GenBank数据库比对分析,检索到与这5个片段有高同源性的已知基因,分别为无机焦磷酸1基因(PPA1)、ErbB2互作蛋白基因(ERBB2IP)、350kD中心体相互作用蛋白基因(CEP350)、核糖体蛋白L27a基因(RPL27A)和Ⅱ类主要组织相容复合物下调因子基因(IK),实时定量PCR检测和SPSS统计分析结果表明,PPA1、ERBB2IP和CEP350mRNA表达量随胚胎发育进程呈不同程度的降低趋势,RPL27AmRNA表达量在囊胚期由降低转为升高,IK的转录物含量在囊胚期前呈波动变化,到囊胚期显著降低。本研究结果为进一步了解卵母细胞成熟对后续胚胎发育的影响以及合子基因组激活机制提供了实验依据。 相似文献
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利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS7( NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein7)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的完整CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能的预测,并用半定量RT-PCR技术分析了NDUFS7基因在猪的11种组织以及在33、65和90d胚胎和成年猪骨骼肌中的相对表达水平。结果表明,将NDUFS7基因定位于猪的2号染色体2q21-q24,与标记SW395紧密连锁。该基因的CDS全长648bp,编码215个氨基酸,预测编码的产物具有一个高度保守且与能量生成有关的NouB结构域和3个激酶的磷酸化位点。同时,半定量RT-PCR结果显示,NDUFS7基因在猪的11种组织中均有表达,但表达量有差异;在65和90d胚胎骨骼肌中的表达量较高,而在33d胚胎和成年猪骨骼肌中的表达量相对较低。 相似文献
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为了尝试利用分子育种技术高效选育实用性籼稻优质香型不育系,本实验对参试的13份水稻籼型(Oryzasativa ssp.indica)保持系进行了稻米香味性状测定,并采用香味基因(fgr)的功能分子标记1F/1R进行PCR分子检测,发现宜香B有浓烈香味,PCR扩增出Ⅰ型带(fgr/fgr),其余材料均为Ⅱ型带(Fgr/Fgr)。利用该分子标记,对Ⅱ-32B/宜香B配组的F1～3进行了1F/1R标记多态性鉴定,结果表明,分子标记具有共显性特性,表现为单基因控制模式。经过F2代分子标记辅助选择,F3代入选株系的香味特异性标记1F/1R纯合率高达96.0%。在F3选留的Ⅰ型纯合系基础上,结合株型、粒型、透明度、垩白度、糊化温度、直链淀粉等指标的田间和室内选择,选株与Ⅱ-32A成对交,并以后每世代保持约50～60对成对交规模,连续5代选株成对交,最终获得了一批性状稳定的优质香型不育系(保持系),暂定名为浙农香A(B)系列。实验还选取4份代表性不育系(保持系)作了较为全面的特性鉴定,结果表明,该4份不育系(保持系)的1F/1R均为Ⅰ型标记,香味明显,且株型良好、粒型细长、高透明度、低垩白、中等糊化温度、中等AC含量,是... 相似文献