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1.
犬瘟热病毒(Canine disremper virus,CDV)是导致犬科等多种属动物发热、腹泻、幼仔死亡等症状的传染病病原体,建立针对CDV的快速灵敏的诊断方法对于该病的防治具有重要意义。本研究利用RT-PCR方法扩增得到CDV-M基因,构建原核重组表达载体p ET-28(a)-CDV-M,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了该蛋白的表达和纯化,Western blot验证重组蛋白的抗原性,用纯化的重组蛋白his-CDV-M作为抗原包被酶标板,ELISA方阵实验确定该重组蛋白的包被浓度,建立了检测临床犬血清样品的CDV-M蛋白抗体的间接ELISA方法,比较本实验方法与其他试剂盒之间的特异性和灵敏性。结果表明重组蛋白his-CDVM得到较好表达,纯化后蛋白浓度为2.840 mg/m L。Western blot结果表明重组抗原能与犬瘟热阳性血清进行反应。方阵实验确定抗原最佳工作浓度为8.88μg/m L,抗体最佳稀释度为1∶160,应用本方法检测223份犬血清样品,与进口CDV诊断试剂盒检测结果符合率为96%。本研究建立的基于M蛋白的犬瘟热病毒抗体检测方法具有较高的特异性和灵敏性,为犬瘟热病毒的诊断及M蛋白的功能研究提供了工具。 相似文献
2.
Viperin是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,在进化上高度保守。本研究以小鼠脑组织为原材料,通过RT-PCR扩增得到包括完整open reading frame（ORF）的1 155 bp的viperin基因序列,成功亚克隆并构建了原核表达载体pET-32a-vip,将其转化到大肠杆菌Rosetta中进行原核表达。结果表明：原核表达的重组蛋白viperin主要以包涵体的形式表达,用镍离子亲和层析法获得纯度较高的viperin蛋白,为探讨原核表达的viperin抗原特性,将纯化的viperin蛋白免疫4周龄昆明小鼠,制备得到抗viperin多克隆抗体。经Western blot和IFA检测,该抗体能与真核细胞自然表达的viperin反应,特异性良好且效价高,表明原核表达的viperin具有良好的抗原性。获得的多克隆抗体为进一步研究viperin的抗病毒生物学功能奠定了良好的基础。 相似文献
3.
为制备烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物(TBTV-BSLLi)的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a(+)中,通过热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(plysS),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白.用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清.DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草(Nicotiana tabacumL.)样品及传播介体的检测.本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件. 相似文献
4.
以O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)为研究对象，通过RT-PCR扩增到非结构蛋白3ABC基因，定向克隆到原核表达载体pET-42a上。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测，证明重组载体pET-42a-3ABC成功地在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了3ABC蛋白，这一研究为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。 相似文献
5.
在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因, 克隆至表达载体pET32a中, 构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化至感受态E. coli BL21(DE3) 中, 经IPTG诱导和SDS-PAGE 分析, 可见约42.4kDa 的目的蛋白以包涵体形式表达。Western blotting 分析发现, 表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中, 利用His•Bind试剂盒获得纯化的蛋白, 将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠, 间接ELISA法测得抗体的效价, MTT 法检测免疫小鼠的T 淋巴细胞增殖反应能力。结果说明该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。 相似文献
6.
嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究 总被引：2，自引：0，他引：2
为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用. 相似文献
7.
用PCR方法从苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）基因组中扩增到orf59基因,插入原核表达载体pET-32a(+),构建pET-Ac59质粒,再将该质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为30kDa的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞（Sf9）中orf59基因的表达,结果显示：在感染后的细胞中有两条分子量分别约为38kDa和25kDa蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现：在病毒感染的晚期,Ac59蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。这些研究为下一步深入进行Ac59功能的研究奠定了一定的基础。 相似文献
8.
在分析鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)gB蛋白抗原性的基础上,设计1对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因,克隆到表达载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET-gB1.将pET-gB1转化到感受态大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约42.4kD的目的蛋白以包涵体形式表达.Western blot分析发现,表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应.将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His-Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠,间接ELISA法测得抗体的效价,MTT法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖反应能力.结果说明,该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫. 相似文献
9.
摘要：纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒，与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞sf9，通过同源重组，形成具有感染活性的重组杆状病毒，并利用重组病毒的LacZ表型进行噬斑纯化。纯化后的高效价重组杆状病毒在昆虫细胞中进行表达，表达产物应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（Western-blot）和免疫酶斑点技术（Dot-ELISA）进行分析，确定所表达的蛋白分子量大小约为67KD，且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察，可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，同时设PPV的灭活疫苗免疫组及PBS接种组作为参比对照，检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明，表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒，不仅能诱导小鼠机体产生抗CSFV的特异性CTL反应，还能刺激小鼠产生高效价的抗PPV的特异性抗体。而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。 相似文献
10.
猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的克隆、表达及其免疫原性 总被引：1，自引：2，他引：1
以本实验室分离的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型(Actinobacilluspleuropneumoniaeserotype2,APP-2)菌株HB08的基因组为模板,扩增了2871bp的APP毒素Ⅱ的结构基因apxIIA,并克隆到pET-28a原核表达载体中构建重组表达质粒pET28aIIA,转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,表达的重组蛋白具有良好的反应活性。将表达的蛋白经或不经复性处理,与纯化的天然毒素Ⅱ分别免疫昆明小鼠,同时设PBS空白对照组,每组12只,间隔2周免疫2次,采血检测其抗体效价,二免后2周用致死剂量的APP血清7型(APP-7)菌株(1.08×108CFU(菌落形成单位,colonyformunit)/只)腹腔攻击。结果显示,复性蛋白组的保护率为83.3%,非复性蛋白组的保护率为58.3%,天然毒素蛋白对照组保护率为91.7%,空白对照组小鼠全部死亡,说明复性的重组毒素Ⅱ具有良好的免疫原性。 相似文献
11.
将牛白细胞介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中，并在宿主菌BL21（DE3）中进行表达；用BoIL-18在昆虫细胞中的表达产物制备的兔多克隆抗体作为一抗进行Western blot分析；采用亲和层析法，对表达产物进行纯化；利用MTT染色法研究重组BoIL-18（re BoIL-18）对牛外周血单核细胞(PBMC) 增殖的促进作用；采用双抗体夹心ELISA法研究reBoIL-18诱导脾淋巴细胞产生IFN-γ的情况；采用微量细胞病变抑制法检测reBoIL-18对VSV导致细胞病变的抑制作用。结果:得到了BoIL-18的高效表达产物，表达量为31.8％，Western blot 显示，在44KD处有一特异性条带；纯化后获得了纯度较高的reBoIL-18蛋白；纯化的BoIL-18对PBMC增殖具有明显的促进作用，并且能够促进IFN-γ的诱生和抑制VSV病毒的活性。 相似文献
12.
猪传染性胃肠炎(swine transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触性肠道传染病,是我国法定检疫的疫病。为研究福建省猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)核衣壳蛋白基因(N)的分子特征及其原核表达产物的抗原性,参照GenBank中的TGEV全基因序列,设计合成一对扩增TGEV福建(FJ)分离株N基因的特异性引物,进行克隆和序列分析,结果表明,TGEV-FJ株N基因全长1149bp,编码382个氨基酸(GenBank登录号JQ700302),与国内外23株TGEVN基因的核苷酸同源性,氨基酸同源性进行比较分析,N基因核苷酸的同源性为95.4%～99.8%,氨基酸同源性为96.1%～100%。TGEV-FJ株N基因克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白约为68kD,与预期分子量一致;Western blot分析表明,重组蛋白能与抗TGEV阳性血清反应出现特异性条带;以纯化的重组TGEVN蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性,送检20份猪(Sus scrofa)TGEV阳性血清样本中检出16份阳性结果、10份阴性血清样本中检出9份阴性结果。利用纯化的TGEV重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了1株特异性好并能稳定分泌抗TGEVN蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1-27),间接免疫荧光试验证明,该单抗能特异性识别TGEV全病毒抗原。TGEVN蛋白的单克隆抗体制备为建立TGEV免疫学检测方法提供了基础资料。 相似文献
13.
为鉴定日本血吸虫重组蛋白SjIR(3rSjIR3)诱导小鼠抗攻击感染的免疫保护力,根据已报道的SjIR(3AY251481)的cDNA序列设计1对特异性引物,以日本血吸虫(Schistosoma japonicum)cDNA文库为模板扩增SjIR3基因,克隆到pMD-18-simple-T载体上,测序后进行生物信息学分析。然后将SjIR3基因克隆到pET-32a( )原核表达载体中构建重组质粒pET-32a( )SjIR3,转化Escherichia coli BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果表明SjIR3具有PS50204和SSF69572两个结构域(domain),属泛素样蛋白激酶家族,重组蛋白rSjIR3具有良好的免疫原性。动物保护试验采用昆明小鼠,结果表明rSjIR3及rSjIR3 FCA可诱导小鼠产生高水平的抗体应答及26.63%和36.38%的减虫率,以及34.79%和44.09%的减卵率。表明日本血吸虫rSjIR3可诱导小鼠产生一定的免疫保护作用。 相似文献
14.
祝秀梅;刘在新 《农业生物技术学报》2008,16(1)
通过设计特异性引物扩增得到完整的口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSP）3AB基因,定向克隆到表达载体pET-30a中,获得了重组质粒pET-3AB,并转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),重组菌分别在37℃和28℃条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,观察到37℃培养条件下目的蛋白形成包涵体,在28℃条件下培养目的蛋白以可溶性的形式表达。Western blotting分析表明,表达的目的蛋白能与FMDV感染牛血清发生特异性反应。以纯化的3AB蛋白作为抗原,采用间接ELISA模式检测了部分FMDV感染动物血清和健康动物血清,证明表达蛋白与FMDV感染血清有很好的反应而与健康动物血清无反应。该项研究为建立以3AB为抗原的FMDV NSP抗体检测ELISA方法奠定了基础。 相似文献
15.
设计特异性引物扩增得到完整的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3AB基因,定向克隆到表达载体pET-30a中,获得了重组质粒pET-3AB,并转化大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21(DE3).重组菌分别在37℃和28℃条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,观察到37℃培养条件下目的蛋白形成包涵体,在28℃条件下培养目的蛋白以可溶性的形式表达.Western blot分析表明,表达的目的蛋白能与FMDV感染牛血清发生特异性反应.以纯化的3AB蛋白作为抗原,采用间接ELISA模式检测了部分FMDV感染动物血清和健康动物血清,证明表达蛋白与FMDV感染血清有很好的反应而与健康动物血清无反应. 相似文献
16.
家蚕肌钙蛋白CⅢ(TnCⅢ)是肌钙蛋白C(TnC)的一种亚型结构,本研究利用大肠杆菌表达TnCⅢ融合蛋白,并制备其多克隆抗体.从本实验室的家蚕(Bombyx mori)蛹cDNA文库中搜索到1条编码家蚕肌钙蛋白CⅢ亚型的cDNA序列,将其命名为BmTnCⅢ(Bombyx mori TnCⅢ).该cDNA序列含有完整的ORF,可编码153个氨基酸残基组成的TnCⅢ蛋白.根据该cDNA序列,设计带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物,通过RT-PCR的方法从家蚕蛹总RNA中扩增到BmTnCⅢ亚型基因的完整的ORF序列(GenBank登录号为DQ889211),并将其重组到原核表达载体pET-28a相应的酶切位点上.将获得的重组质粒pET-28a-BmTnCⅢ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白后,在分子量约21 kD处出现融合蛋白条带.用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-Tag BmTnCⅢ,并以此为抗原免疫雄性新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus),制各了该融合蛋白的多克隆抗体.Western blot结果表明,该多克隆抗体具有较高的特异性,可用于后续的组织分布与定位研究. 相似文献
17.
摘要：将鸡（Gallus gallus）的γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB的BamHⅠ位点上，构建真核转移载体pMelBacB-ChIFN-γ，经限制性内切酶消化、ChIFN-γ特异引物PCR鉴定和序列测定，证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacB-ChIFN-γ质粒与杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染sf9昆虫细胞，经3轮蓝斑筛选纯化，获得了重组杆状病毒rBaculovirus-ChIFN-γ。提取病毒DNA经ChIFN-γ特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定，证明获得了纯化的重组杆状病毒，命名为rBaculovirus-ChIFN-γ。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞，收获接种后不同时间的细胞进行SDS-PAGE,结果表明ChIFN-γ基因在昆虫细胞中获得了表达，表达的重组蛋白分子量约为19 kD。应用在大肠杆菌(Escherichia coli )原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIFN-γ多克隆抗体进行Western blot分析，表明表达的重组蛋白具有抗原性。 相似文献
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小反刍兽疫N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种危害严重的急性接触性传染病。为了检测血清中存在的抗PPRV的抗体,本研究利用纯化后的真核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rBacmid-PPRN)作为免疫原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),并使用原核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rpET-PPRN)作为间接ELISA检测抗原,共筛选得到8株抗PPRVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。其中1D5单抗腹水效价达1∶106,分泌单抗亚类为IgG2b。以1D5作为竞争抗体、纯化后的rpET-PPRN蛋白作为包被抗原,建立了检测小反刍兽疫血清抗体的单抗竞争性ELISA(c-ELISA)方法。所建立的c-ELISA方法能够特异性的区分牛瘟阳性血清和小反刍兽疫阳性血清,并具有较高的灵敏度和特异性。应用建立c-ELISA检测方法检测共129份山羊(Capra hircus)血清样品,与标准c-ELISA试剂盒的符合率为96.9%。本研究成功地建立了可特异性检测动物血清中抗PPRV抗体的竞争性ELISA方法,对小反刍兽疫的诊断、疫苗免疫水平的监控及控制其流行具有重要意义。 相似文献
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利用基因重组技术将鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因分段（A和B段）克隆到pGEX—6p-1载体中，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示有明显的融合蛋白表达条带。通过IBV特异性抗体的Western blot检测，两段表达产物均能与抗体发生特异性反应，证明表达产物具有部分抗原性。用Glutathione Sepharose 4B纯化出A段和B段的GST融合蛋白。将纯化得到的融合蛋白免疫家兔。连续免疫3次，将得到的抗体与200 TOCID50（气管环半数感染）/0．1mL病毒工作液在37℃温育1h进行TOC试验。经计算A段抗体的50%血清中和终点为1：18，而B段抗体的50％血清中和终点为1：53，表明这两段的表达产物具有较好的免疫原性，B段表达产物更具有良好的抗原性，适合作为免疫抗原和诊断抗原，具有一定的临床应用价值。 相似文献
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本研究旨在制备抗鸭β-防御素9(AvBD9)蛋白的单克隆抗体.首先用pGEX-6p-1载体表达的鸭AvBD9蛋白做抗原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠(Mus musculus),免疫3次,每次间隔15 d,融合前3 d加强免疫1次.然后将鸭AvBD9基因亚克隆到原核表达载体pET-32a的EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET-32a-duckAvBD9,将重组质粒转化至大肠杆菌(Escheriohia coli)BL21(JM83-)株,经IPTG诱导表达、镍柱纯化后做检测原.用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western blot相结合的方法进行筛选及鉴定,经3次亚克隆后得到1株单抗,命名为1F11.结果表明:重组pET-32a-duckAvBD9蛋白大小为26kD,与预期大小一致,并能被抗pGEX-duck AvBD9阳性血清识别.单抗1F11在pGEX-6p-1空载体蛋白、pGEX-duck AvBD9蛋白、pGEX-duck AvBD10蛋白、pGEX-chicken AvBD10蛋白中能够特异性识别pGEX-duckAvBD9蛋白.其亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链.本研究获得了1株鸭AvBD9蛋白的单克隆抗体,单抗1F11的特异性良好,可用于对鸭AvBD9蛋白的生物学功能及活性作进一步研究. 相似文献