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1.
采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用BamHⅠ、NheⅠ酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamHⅠ酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C.将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C. 相似文献
2.
含O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的羊痘病毒弱毒株转移载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用已构建的口蹄疫病毒O/China99毒株的pMD18-T-P1-2A-3C载体和p-EGFP-N1-P7.5载体,分别通过HindⅢ、NheⅠ酶切,将基因P1-2A-3C连接到线性载体p-EGFP-N1-P7.5,构建了载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C。将EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。通过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定。结果表明,成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C转移载体。 相似文献
3.
4.
根据拟南芥RS基因的编码序列设计引物,利用PCR技术从pGADT7-RS重组质粒上扩增到RS基因编码区476 bp片段。利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建RS基因沉默表达载体,为进一步研究该基因在植物与蛋白激发子HpaGXoo互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将RS基因片段连接到pUCm-T载体上,用Pst I/BamH I和Pst I/Xho I分别对pUCm-RS重组载体进行酶切,得到2个RS基因片段;先后将其连接到用相应限制酶酶切的pBSSK-in载体上,构建成pBSSK-RS-in-RS重组载体,该重组载体中的2个RS片段大小一致,反向重复;最后用Sac I/Kpn I酶切pBSSK-RS-in-RS载体得到RS-intron-RS片段,连入表达载体pCAMBIA1301中,构建成该基因的沉默表达载体。 相似文献
5.
采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代. 相似文献
6.
［目的］研制小反刍兽疫羊痘活载体疫苗。［方法］利用PCR技术扩增小反刍兽疫病毒H基因,克隆到pGEM-T easy载体,Nhe Ⅰ和Hin-d Ⅲ双酶切重组质粒,将目的片段插入到真核表达载体pEGFP-N1-P7.5中,得到重组载体pEGFP-N1-P7.5-H,重组载体Hin-d Ⅲ、NheⅠ双酶切片段EGFP-P7.5 H平末端连接到KpnⅠ 酶切后的载体pUC119-TK中,得到通用转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-H。［结果］经酶切鉴定及PCR扩增检测,表明构建载体正确。pUC119-TK-EGFP-P7.5-H转染羊痘病毒感染的BHK21细胞,48 h后报告基因表达。［结论］该研究为研制小反刍兽疫基因工程活载体疫苗奠定基础。 相似文献
7.
分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶HindIII酶切,电泳后显示4 kb的trp3iar基因的目的片断和10 kb的载体片断,进一步测序证明重组质粒连接正确,成功构建了草菇的表达载体pSAGF。 相似文献
8.
含绿色荧光蛋白及trp3iar基因的草菇表达载体的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶HindIII酶切,电泳后显示4 kb的trp3iar基因的目的片断和10 kb的载体片断,进一步测序证明重组质粒连接正确,成功构建了草菇的表达载体pSAGF。 相似文献
9.
采用定点突变技术,将组成人胰岛素原基因的C、A两条肽链进行了PCR突变连接,构建了人胰岛素C、A突变基因。采用T-A法将PCR产物B、CA克隆到T载体,分别构建了中间体pHB和pHCA,其测序结果与GenBank公布的一致。应用BamH I和Sse8387 I对pHB和pHCA进行双酶切,然后将回收纯化的片段进行定向连接,构建了重组质粒pHBCA,酶切分析证实重组质粒pHBCA构建成功。 相似文献
10.
[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。 相似文献
11.
含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒Fa株重组猪细小病毒VP2基因表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切含PRVFa株gI片段的质粒pPI,补平连接后得到去除EcoRⅠ、HindⅢ、EcoRⅤ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点的大小约5.7kb的质粒pPI-2,再以CMV早期启动子控制的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因,将其插入pPI-2中gI基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点,构建了以gI为同源序列含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP。然后根据AnaI.Ranz等报道的猪细小病毒(PPV)NADL-2株的序列,设计一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物,扩增得到VP2基因后,将其插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,首次构建了含PPVVP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2,为进一步构建PRV重组PPVVP2基因活载体疫苗奠定了基础,同时EGFP的引入也为进一步研究PRV在机体内的定植和感染机理打下了基础。 相似文献
13.
根据已发表的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)Alfort株和Brescia株的全基因组序列,设计2对引物P1/P2和B1/B2,在B1和B2的5''端分别加上XhoI和ApaI位点,以CSFVShimen株细胞毒为材料一步法提取总RNA,并以此为模板采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR),成功地扩增到约2.0kb的片段,将此PCR产物回收后与pMD18-T连接、转化,获得重组质粒,经PCR扩增,限制性酶切(BamhI/HindШ)和序列部分测定鉴定为阳性重组质粒P80-T。将P80-T分别经XhoI和ApaI酶切消化、回收后,与经XhoI/ApaI酶解的真核表达载体PEGPF-C1连接、转化,获得重组质粒,经PCR,XhoI和ApaI限制性酶切和序列测定鉴定为真核表达质粒P80-P,目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。为下一步在哺乳动物细胞中表达猪瘟病毒p80蛋白奠定了基础。 相似文献
14.
鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建 总被引：1，自引：0，他引：1
用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性. 相似文献
15.
银杏GbPAL基因启动子表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为弄清GbPAL启动子调控类黄酮代谢的功能,采用双酶切方法,用BamH I+HindⅢ将GbPALp与植物表达载体pBI121分别酶切纯化,通过T4DNA连接酶将GbPALp片段连接到已切除35S启动子的植物表达载体pBI121上,并转化到农杆菌LBA4404上,然后进行菌落PCR及酶切鉴定。结果表明:扩增到的GbPALp片段成功引入了BamH I和HindⅢ酶切位点,GbPALp酶切后与酶切前的条带大小一致;将酶切后的空质粒和引入酶切位点的目的片段进行连接转化后,含目的基因pBI121:GbPALp:LBA4404菌落培养成功。成功构建了GbPAL基因启动子真核表达载体pBI121:GbPALp。 相似文献
16.
口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建 总被引：4，自引：4，他引：4
通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上. 相似文献
17.
采用高保真酶用PCR方法从pM018-BADH载体上扩增出目的基因BADH,替换pBI121质粒中的gus基因,构建pBI121-BADH植物表达载体。经过2对引物检测,证明pBI121-BADH载体构建正确。又从pBI121-BADH质粒中扩增出35s—BADH-nos片段,所用引物加上了Nhe I和Cla I接头,扩增片段经回收后插入到pUCm—T载体中测序。测序表明,所扩增的35s—BADH—nos片段与模版同源性为100％。将测序正确的质粒pUCm-35s—BADH-nos用Nhe I和Cla I酶切后连接到进行了相同酶切的pBI121-xylA载体上,用35s—BADH—nos片段取代pBI121-xylA载体上的npt Ⅱ基因片段,构建pBI121-xflA-BADH双元植物表达载体,该载体经PCR检测和酶切检测,与预期结果相同。最后,用Pme I、Cla I从pBI121-xylA—BADH上切出片段35s—BADH—nos,将其连接到进行了相同酶切的pt4CL1-P载体上,使35s—BADH-nos片段取代pt4CL1-P载体上的npt Ⅱ基因片段,构建了无选择标记的反义4CL—BADH植物双元表达载体。 相似文献
18.
采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达. 相似文献
19.
芽孢杆菌SP A3β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达 总被引：5，自引：0，他引：5
将含β-葡聚糖酶基因的重组克隆载体进行亚克隆,用BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,蛋白质电泳结果表明在25.0 KD处有表达带,酶活力达85.9U/mL,为出发菌的31多倍. 相似文献
20.
口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病.为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体PI-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C.将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法检测血淋巴中的表达产物,结果显示目的蛋白在感染病毒后108 h的蚕血淋巴中表达量最高,A型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1024,而亚洲Ⅰ型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为2048.结果表明A型和亚洲Ⅰ型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达. 相似文献