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1.
以感病烟草品种为材料,提取总RNA,根据已报道的eIF4E基因cDNA的序列,在保守区域和差异区域分别设计特异性引物,采用RT-PCR克隆出eIF4E基因的目的片段。以中间载体pKANNIBAL和表达载体pART27为基础,构建成以CaMV35S启动子为驱动的含有“正向eIF4E目的片段-pdk intron-反向eIF4E目的片段”的RNAi烟草表达载体,构建的RNAi载体将抑制eIF4E基因表达,为了解其基因功能和烟草抗病毒育种打下基础。 相似文献
2.
《分子植物育种》2017,(2)
RNA干扰是一种双链RNA引发的转录后基因沉默技术,具有特异性和高效性,已成为一种基因功能研究的有效手段。在RNA干扰技术中,干扰片段的选取方式会影响基因沉默的效果。但是,目前并无选取干扰片段的固定标准。本研究以水稻多胺转运蛋白基因OsPUT1为对象,在CDS前部、中部和后部分别设计了三种不同干扰片段,构建基因三个RNAi载体,借助农杆菌EHA105介导水稻遗传转化,得到三种转基因苗;通过RT-PCR和Q-PCR技术检测目的基因的表达,结果显示三个干扰部位都具有一定的沉默效果,且在CDS的中间位置干扰效果最好。说明OsPUT1在进行RNAi载体构建时,应考虑在CDS的中间位置进行干扰。 相似文献
3.
为了研究甜瓜ERF(ethylene-responsive factor)亚家族基因在果实成熟过程中的功能,本研究以甜瓜(Cucumis melo L.)品种河套蜜瓜为材料,克隆得到甜瓜ERF亚家组成员之一Cm ERFIV-3(MELO3C021306)基因c DNA,其开放阅读框(ORF)长为702 bp,编码233个氨基酸。分别构建了Cm ERFIV-3基因的超表达载体p PZPIV-3和RNAi载体p ARTIV-3,采用农杆菌介导的瞬时表达技术将含有重组质粒的农杆菌菌液注射到成熟期甜瓜果实中。结果显示,注射超表达载体的部位与对照相比,23.3%样品出现提前变黄的表型,而注射RNAi载体的部位与对照相比,20%样品出现持绿的表型。实时荧光定量PCR结果表明,注射超表达载体部位的目的基因的表达量是对照的2.37倍,而注射RNAi载体部位的目的基因的表达量是对照的0.24倍。这些结果初步表明Cm ERFIV-3基因参与甜瓜果实成熟过程。 相似文献
4.
《分子植物育种》2020,(11)
为了构建具有发夹结构的RNAi表达载体来研究拟南芥AtZFN3基因表达的效果。根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)锌指蛋白AtZFN3基因序列,设计含有酶切位点的两对特异性引物。以拟南芥cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正、反义DNA片段,将正、反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置上,构建含有发夹结构的RNAi载体pART-ZFN3。利用农杆菌介导法,将pART-ZFN3转化到拟南芥中,PCR检测证实获得了5株转基因植株,经荧光定量PCR检测,证明了转基因植株中AtZFN3基因表达量显著低于未转基因的植株。结果表明:具有发夹结构的RNAi载体pART-ZFN3已构建成功,它对拟南芥AtZFN3基因的表达具有抑制作用,为深入分析拟南芥AtZFN3基因功能提供了基础。 相似文献
5.
RNAi机制可以通过dsRNA诱导同源mRNA的降解,从而导致该基因转录后沉默。RNA干扰作用从发现以来就具有了利用转录后基因沉默（PTGS）来进行抗虫的一种潜在可能性。针对dsRNA的这种作用,研究中提取蚜虫RNA,克隆出蚜虫Cathepsin B基因的干扰片段并构建出RNAi载体,转入本氏烟草中,在转基因烟草体内表达dsRNA。成功构建RNAi载体后,通过农杆菌转化和叶盘法将RNAi载体导入烟草中并采用组织培养方法培养出转基因烟草,通过PCR鉴定显示15株生根的转基因烟草中14株显示阳性。提取转基因烟草的RNA进行RT-PCR和Northern表达分析显示转基因烟草植株中dsRNA表达的存在。实验结果说明了在转基因植物体内表达RNAi载体可以产生dsRNA,从而在蚜虫进食植物时达到利用dsRNA抗蚜虫的作用。 相似文献
6.
7.
水稻OsbHLH116基因属于bHLH家族转录因子。本研究依据简易RNAi技术原理,在OsbHLH116基因编码区选取一段60 bp序列作为干扰目的片段,根据目的片段序列化学合成2条长寡核苷酸链,使其3'端9个碱基互补配对,经退火延伸得到具有反向重复序列的小干扰片段。小干扰片段和载体pTCK303经一次酶切和连接即可得到OsbHLH116-RNAi表达载体。经菌落PCR验证后利用农杆菌介导法转化水稻品种新丰2号,利用GUS染色筛选获得转基因阳性植株。通过qRT-PCR对选取的三组转基因株系中OsbHLH116基因表达量验证,结果显示OsbHLH116基因表达极显著降低,表明OsbHLH116基因简易RNAi载体构建成功并发挥干扰作用。对OsbHLH116基因功能进行初步分析发现,与野生型新丰2号相比,OsbHLH116-RNAi株系种子萌发率显著降低。 相似文献
8.
病毒诱导的基因沉默（VIGS）具有独特优势,被广泛应用于基因功能验证。高效基因沉默体系的建立和优化是对目标基因功能进行研究的前提和基础。以番茄品种money maker和携带八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因序列的TRV病毒载体为材料,研究了农杆菌不同OD值、不同侵染方法以及侵染后不同培养温度对PDS基因沉默株率的影响。结果表明,农杆菌OD值分别为0.50、1.00和1.50时,PDS基因的沉默株率分别为5%、13%和6%;当农杆菌OD值为1.0时,采用注射法、真空浸润法和注射处理24h后再进行真空浸润后的PDS基因沉默株率分别为13%、30%和15%;侵染后的培养温度对于基因沉默株率也有显著影响,在25℃时的沉默株率为13%,22℃时沉默株率达到46%。以上研究表明,农杆菌OD值为1.00时,注射24h后再进行真空浸润,接种后植株在22℃下生长能够提高番茄目标基因的沉默株率。 相似文献
9.
《分子植物育种》2016,(9)
为了研究番茄LCYE基因对其果实中番茄红素含量的影响机制,培育高品质番茄品种,在Gen Bank中根据已知的LCYE(ID:544 129)扩增出337 bp的保守序列;根据KJ 561 284.1扩增出2 203 bp的果实特异性启动子E8;查找番茄LCYE的内含子,选择第三个长112 bp的Intron片段;利用同尾酶构建出载体p Ri E8-LCYE,与p CAMBIA1301连接构建出果实特异性RNAi表达载体p CRi E8-LCYE,测序表明载体构建正确。农杆菌介导,叶盘法转化番茄,PCR检测表明得到了转基因番茄植株。与同样条件下番茄LCYB基因干扰载体的遗传转化过程相比,表明:对LCYE基因的干扰使番茄子叶开始褐化时间提前,且褐化率更高,说明筛选培养时子叶的褐化与所干扰的基因也有关系。 相似文献
10.
为了研究木薯淀粉合成酶关键基因AGPase在木薯淀粉合成中的作用,根据GenBank中其他物种AGPase小亚基基因序列,从高淀粉木薯‘辐选01’中克隆得到含3’末端的909 bp的基因片段,回收克隆测序。结果显示,克隆获得片段与基因库中登录的蓖麻、毛果杨、甜橙、番薯、蜜柑、大豆同源性依次达到91%、91%、87%、86%、86%及85%。将阳性克隆与PBI121载体进行双酶切、连接,构建植物反义表达载体PBI121-AGPss,并将其导入农杆菌,得到农杆菌工程菌株。为进一步开展木薯淀粉合成相关的基因调控、转基因及基因功能研究奠定基础。 相似文献
11.
《分子植物育种》2016,(8)
本研究利用RNA干扰的方法抑制紫苏ω-3脂肪酸脱氢酶基因FAD3的表达,以期得到低ALA含量的转基因植株。根据紫苏FAD3基因(Gen Bank登录号为KC990786.1)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,通过扩增获得长度为258 bp的RNA干扰片段,构建以Ca MV35S启动子驱动表达的紫苏FAD3基因RNA干扰表达载体p FGC5941M-FAD3I,将该载体转入根癌农杆菌GV2301后,采用农杆菌介导法进行紫苏的遗传转化,经除草剂抗性筛选和PCR检测获得1株阳性转基因植株。利用荧光定量PCR技术对野生型和转基因阳性苗的FAD3基因进行了表达分析,结果显示,阳性植株中FAD3基因的表达受到显著抑制,FAD3基因表达量降低了80%,说明此研究构建的FAD3基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的,为FAD3基因在不饱和脂肪酸代谢过程中的功能研究提供了理论依据。 相似文献
12.
利用RNAi干扰技术研究不同基因对花粉发育、卵细胞发育和合子胚发育的影响是一种重要的手段。本研究通过筛选水稻在生殖发育过程中的9个重要调控基因,构建基因的RNAi表达载体,分析转基因植株育性及相关性状表型,以期探明RNAi表达载体对靶标性状的干扰效应。其中,AT61~AT63、AT64~AT66、AT67~AT69表达载体分别靶标花粉育性、卵细胞发育以及合子胚发育的调控。结果表明,除RNAi表达载体AT64没有获得转基因植株外,其余8个RNAi表达载体均获得了转基因植株;对T0代转基因植株的花粉育性、结实率以及潮霉素筛选(40 mg/L)发芽率检测的统计结果显示,RNAi表达载体AT62(花粉发育调控)、AT65(卵细胞发育调控)和AT67(合子胚发育调控)的干扰效应较强。本研究结果将为创制新型水稻基因工程不育系提供策略和选择。 相似文献
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紫花苜蓿锌指蛋白基因RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化 总被引：2，自引：1，他引：1
根据紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(GenBank登录号为EU624138)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R。利用农杆菌介导方法,将pART-F-R转化到紫花苜蓿中,经过PCR检测,获得了3株转基因植株。经过RT-PCR检测,证明转基因植株中MsZFN基因表达量明显低于未转基因的植株。结果表明,已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,它可有效的抑制紫花苜蓿MsZFN基因。 相似文献
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靶向BnSVP的CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。 相似文献
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葡萄病毒AMP基因RNA干扰载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
RNA干扰（RNAi）介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。本文以GVA运动蛋白（MP）基因为模板扩增出了418 bp的基因片段,根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向分别插入到载体pFGC5941内含子的两侧以便其转录过程中高效产生RNA发夹结构。经PCR扩增证明已成功构建以GVA MP基因为靶标的干扰载体pFGC5941-GVAFR,并成功转入农杆菌EHA105中,为后续探讨干扰载体的干涉效果奠定了基础。 相似文献
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持绿基因(Stay Green gene)在植物衰老过程中起到了重要的作用。本研究利用同源序列PCR方法、Gateway重组技术和子叶节遗传转化方法,对大豆持绿基因Gm SGR进行RNAi载体的构建,并将其转入到大豆受体中,获得转基因阳性植株。结果显示,分别获得长度为786 bp的Gm SGR1 CDS序列,长度为816 bp的Gm SGR2 CDS序列及355 bp的att B-Gm SGRi干扰片段。依据RNAi引物设计原则和Gateway重组技术,将干扰片段依次导入到入门载体p DONR221和表达载体p B7GWIW2(Ⅱ)中,并转化农杆菌EHA105,通过子叶节法将其转入大豆受体中,最终获得阳性转基因植株。本研究在m RNA水平沉默同源靶基因,干扰大豆Gm SGR基因功能,结果显示其叶片和种子有趋向持绿的特性。本研究为探究持绿基因的遗传效应,作用机理提供实践参考,为高光效大豆的遗传改良,探讨植物衰老延缓机制,提高产量和品质等提供理论支持。 相似文献
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病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)是依赖于RNA干扰(RNA interference, RNAi)快速降解靶标基因分析其功能的一种技术,RNAi属于植物天然防御机制的一部分。与其他植物基因功能验证方法相比,VIGS技术操作简单、见效快、无需转基因。番茄是中国乃至世界重要大宗蔬菜,也是现代蔬菜的主导产业,自从番茄基因组测序完成,逐步成为果实类基因功能研究中的模式植物,本研究归纳总结了近年来VIGS技术在番茄基因功能中研究与应用,以期为茄科蔬菜乃至园艺植株基因功能研究提供参考与借鉴,为加速蔬菜乃至园艺作物基因功能研究提供参考。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(11)
为了探究金针菇FIP-fve基因对金针菇本身的生物学功能,本研究克隆FIP-fve基因正反片段并构建其RNAi载体,并将其转化农杆菌LBA4404,建立以农杆菌介导的金针菇遗传转化体系。双酶切琼脂糖电泳检测结果表明成功构建了FIP-fve基因的RNAi载体:p TCK303-fve(F)-fve(R),并用液氮转化法获得重组农杆菌转化子。金针菇遗传转化以菌丝体为外植体,潮霉素B(Hygromycin B)和头孢霉素(Cephalosporins)使用浓度分别为9μg/m L和600μg/m L。重组农杆菌浓度OD600为0.5,侵染金针菇菌丝体30 min,共培养培养基AS使用浓度为200μg/m L,共培养25℃3 d,抗性筛选10 d。最终通过潮霉素抗性筛选和PCR检测从60个外植体中筛选得到5个金针菇遗传转化子,转化率为8.33%。经过连续培养,对比观测转化子和野生型金针菇,FIP-fve基因沉默的金针菇转化子菌丝的生长在第3天、第6天和第10天明显慢于野生型金针菇菌丝。初步说明FIP-fve基因对金针菇菌丝体时期的生长发育具有一定调节作用,这为研究金针菇FIP-fve以及FIP对真菌本身生物学功能提供一定研究基础和直接证据。 相似文献