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1.
【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。 相似文献
2.
【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测TroJAK3重组蛋白表达情况。【结果】PCR扩增片段长度为3 333 bp,经双酶切鉴定、测序确认序列和开放阅读框正确,结果显示成功构建重组质粒pET-32a-TroJAK3。经终浓度为1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明TroJAK3重组蛋白以包涵体形式大量表达,分子量约为140 ku。经Ni-IDA树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。Western blot检测结果显示有140 ku的条带,表明TroJAK3重组蛋白能被抗His抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-TroJAK3,纯化得到高纯度的TroJAK3融合蛋白。 相似文献
3.
【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。 相似文献
4.
【目的】Doublesex 属于 DMRT 基因家族成员之一，在控制性别特异性分化中起关键作用。克隆罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）Doublesex 基因（MrDsx）的开放阅读框序列，构建重组质粒并诱导其表达，纯化获取罗氏沼虾重组蛋白 MrDsx，可为后续开展罗氏沼虾 MrDsx 基因的功能研究提供基础数据。【方法】基于罗氏沼虾 MrDsx 的开放阅读框序列，通过特异 PCR 产物与表达载体 pET-32a（+）连接，获得重组质粒 pET-32a-MrDsx，将其转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，构建罗氏沼虾 MrDsx 基因的原核表达细胞。利用异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）对阳性转化细胞进行诱导表达，并以 SDS-PAGE 电泳，Western blot 和质谱分析检测诱导表达的重组蛋白。【结果】以罗氏沼虾性腺 cDNA 为模板，利用 MrDsx 基因的特异引物，PCR 扩增获得了约 660 bp 大小的单一 DNA 条带。经测序确认为 MrDsx 基因的 ORF 序列。重组质粒 pET-32a-MrDsx转化后的感受态细胞经 IPTG 在 37 ℃条件下诱导 4 h 后获得罗氏沼虾重组蛋白 MrDsx。当 IPTG 终浓度为 0.1~0.5 mmol/L 时，重组蛋白 MrDsx 的表达量可达到峰值。可溶性分析显示，重组蛋白 MrDsx 主要以包涵体形式表达，经 8 mol/L 尿素溶解、Ni 柱纯化及透析复性后，SDS-PAGE 电泳和 Western blot 检测发现重组蛋白的相对分子量约 55 kD，且条带单一，表明重组蛋白 MrDsx 能被鼠抗 His-tag 单克隆抗体特异性识别。质谱分析结果显示，片段化肽段与理论的氨基酸序列相符，匹配度达到 100%。【结论】成功获得了 MrDsx 基因原核表达的重组质粒pET-32a-MrDsx。诱导表达的重组蛋白经溶解、纯化及复性后，可形成高纯度的活性罗氏沼虾 MrDsx 重组蛋白，为后续开展罗氏沼虾 MrDsx 基因的功能研究、互作蛋白的筛选和性别调控机制的解析提供初步依据。 相似文献
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【目的】构建猴痘病毒B20R蛋白原核表达系统,并评价原核表达获得的融合蛋白免疫原性,为后续的猴痘病毒检测及新型治疗方法开发提供技术支撑。【方法】参照GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列,按照大肠杆菌密码子偏好性对B20R基因DNA序列进行优化,人工合成B20R基因并将其分别克隆至表达载体pET-28a和pET-32a以构建原核表达载体;以构建的2种原核表达载体分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后使用SDSPAGE和Western blotting检测融合蛋白B20R的表达情况。通过控制变量法优化融合蛋白B20R的诱导表达条件,使用Ni柱亲和层析进行纯化;以纯化的融合蛋白B20R经腹腔注射免疫昆明小鼠,定期采集昆明小鼠血样,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】将B20R基因克隆至表达载体pET-32a能成功构建原核表达载体pET-32a-B20R,经IPTG诱导后,可在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达出融合蛋白B20R,且主要以不可溶的包涵体形式进行表达。融合蛋白B20R最佳诱导表达条件为37℃下以0.6 mmol/L IPTG诱导12 h,Ni柱亲和层析纯化... 相似文献
6.
【目的】克隆鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ-10株VP2基因,构建其原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行高效表达。【方法】根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV BJ-10株VP2基因;将目的基因插入pMD18-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET-32α中,转化入JM109,经IPTG诱导表达,对产物进行SDS-PAGE电泳分析,确定IPTG的最佳诱导表达时间和浓度。【结果】克隆到了全长1 356bp的IBDV BJ-10株VP2基因;PCR、酶切鉴定分析表明,成功构建了重组质粒pET-32α-VP2;SDS-PAGE电泳分析表明,在宿主菌JM109中成功表达了约为60ku的VP2蛋白;IPTG诱导表达时间以4.5h为宜,诱导最佳浓度为0.8mmol/L。【结论】成功克隆了IBDV BJ-10株VP2基因,并在大肠埃希菌中表达了VP2蛋白。 相似文献
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M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一，具有细胞因子样功能，在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆(Paralichthys olivaceus)M17蛋白的多克隆抗体，将M17基因插入pET-32a原核表达载体，构建M17基因原核表达质粒p ET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，通过IPTG诱导M17蛋白表达，利用NiNTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体(抗血清)。结果显示，IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku,M17重组蛋白主要以包涵体表达为主；Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597μg·mL-1；多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16，经Western blotting分析可见单一目的条带，说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知，M17重组蛋白表达成功，且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。 相似文献
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【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。 相似文献
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【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。 相似文献
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【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分析。【结果】成功克隆了IHNV G蛋白基因,该基因长度为1 527bp。成功构建了原核表达质粒pET-32a-G,诱导表达出约76ku的产物,与预期分子质量大小相符。Western blot分析结果显示,所表达的G蛋白能够被小鼠抗IHNV血清识别。间接ELISA结果显示,小鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV全病毒。【结论】成功构建了IHNV G蛋白原核表达系统,重组G蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。 相似文献
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七子花叶片蛋白组分含量动态分析 总被引：1，自引：0，他引：1
对七子花叶片中5种蛋白组分含量的动态变化进行了研究。结果表明七子花叶片的总蛋白含量变化曲线呈“W”型,叶片生长初期含量基本保持稳定,5月中旬含量开始下降,并且下降幅度较大,6月中旬达一低值后,其含量迅速上升,到7月中旬（盛花期）达一峰值,接着其含量下降,到8月中旬达到最低,后又上升直至落叶时达到最高值。水溶蛋白含量季节性变化呈“低-高-低-高”,在叶生长初期上升,峰值出现在5月中旬,以后逐渐下降,到7月中旬达最低值,之后缓慢上升,落叶前达到最高值。盐溶蛋白在叶生长初期迅速下降,到5月中旬达最低值,后一直呈上升趋势。醇溶蛋白与碱溶蛋白在叶生长初期有所下降,至6月中旬达到最小值,以后迅速上升,至7月中旬达到高峰后大幅度下降,在落叶前又有所回升。杂蛋白在叶生长初期迅速下降,至5月中旬达到最低值后,基本趋于稳定。推测水溶蛋白、盐溶蛋白和醇溶蛋白、碱溶蛋白与七子花的展叶和开花生理过程有密切关系。西北林学院学报22卷第6期杨蓓芬等七子花叶片蛋白组分含量动态分析 相似文献
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动物的生长发育速度实质反映了体蛋白沉积量的变化。体蛋白沉积量主要受蛋白质合成和蛋白质分解两方面的共同影响 ,蛋白质合成除受到基因调控制约外 ,还受到饲料及营养因素诸如锌、铬、脂肪酸及生长激素水平等的影响。蛋白质的降解与日粮组成、采食量、饲喂次数及神经系统和胃肠产生的生产抑素有关。文章通过对体蛋白合成与降解规律及饲料营养成分对体蛋白的合成及降解影响的探索 ,提出了提高蛋白质饲料利用率 ,使动物生产实现最大化的应用前景 相似文献
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HLA-G1的基因表达、纯化及其活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。 相似文献
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猪圆环病毒是单链环状DNA病毒,其基因组中包含多个阅读框,其中2个主要的阅读框分别编码复制起始蛋白Rep和Rep'以及病毒衣壳蛋白:Rep和Rep'结合由PCV1的部分复制起点组成的双链DNA片段,但这2种蛋白的结合位点有细微差别;Rep蛋白不能单独启动病毒的复制,只有和Rep'蛋白一起才能启动PCV病毒的复制;PCV1感染PK15细胞后,用实时PCR检测rep和rep'转录子的数量,发现这2种转录子的比率随着时间的推移而不断发生变化;病毒衣壳蛋白基因是PCV基因间唯一变化很大的基因,其编码衣壳蛋白是PCV主要的免疫原性蛋白,其氨基端41个氨基酸与PCV2在细胞核内的定位有关. 相似文献
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Guided pesticide is an unique compound resulted from the conjugation with carrier (amino acid, protein, sugars, etc) and the active pesticide ingredient. One of the attributes of the guided pesticide is its potential to accumulate at the site of the damaged points caused by pest or at the site of entry to the target pests, such as via inhalation, cuticular penetration, and oral digestion. Movement protein (MP) is a kind of protein coded by plant virus. A genetic fusion between green fluorescent protein (GFP) and movement protein resulted in the expression of a fluorescent fusion MP-GFP protein, which was fully biologically active in mediating the cell-to-cell spread of virus. In order to obtain a suitable carrier for a pesticide,fluorescent carrier MP-GFP was constructed. It was found that the recombinant MP-GFP protein was the inclusion body.The results indicated that optimized cultural condition for expression of recombinant MP-GFP protein was incubation at 37℃ for 2 h and induction with 0.2 mmol L-1 IPTG (isopropyl-β-dthiogalactopyranoside) at 25℃ for 4 h. MP-GFP protein was purified by using Ni-NTA resin. The expressed recombinant MP-GFP protein had both the fluorescence character of report GFP gene and moving character of movement protein. It could provide a guided carrier for studying the guided pesticide. It could also provide convenience for studying the delivery and distribution of the guided pesticide ingredients in the plant. 相似文献
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为探究葡萄糖调节蛋白94(GRP94)对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)增殖的影响,以及GRP94与PRV结构蛋白之间的相互作用。利用慢病毒转染构建GRP94基因过表达的BHK-21细胞,以及CRISPR/Cas9技术构建GRP94基因敲除的BHK-21细胞,检测PRV感染不同细胞的增殖水平,比较内质网应激相关蛋白表达水平,探索GRP94与PRV结构蛋白之间的互作关系。结果表明,GRP94基因过表达细胞株显著有利于PRV增殖,而GRP94基因缺失细胞株对PRV增殖无显著影响。蛋白免疫印迹结果显示,在GRP94基因缺失细胞株中,GRP78表达水平显著上调。免疫共沉淀结果表明,GRP94与gB、gD、gL具有相互作用。GRP94基因过表达有利于PRV增殖,检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)相关蛋白,研究GRP94在病毒增殖过程中的具体作用,可为PRV与内质网应激提供分子方面的研究基础,于对抗PRV病毒的感染具有重要意义。 相似文献
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饲料真蛋白质含量与饲料品质检验方法的探讨 总被引：1，自引：0，他引：1
魏丽红 《辽宁农业职业技术学院学报》2009,11(5):4-5
以16种饲料原料为研究对象,测定其粗蛋白质与真蛋白质含量。结果表明,16种饲料原料中,真蛋白质占粗蛋白质的比例变幅为45.42%-90.74%。酒精粉、鱼粉、微生态制剂（猪）、微生态制剂（蛋鸡）、华润酒精蛋白、沈阳酒精DDG、DDGS、沈阳玉米脐粕的真蛋白质占粗蛋白质的比例超过了80%,其余种类饲料原料的真蛋白质含量远低于粗蛋白质含量,豌豆粉和精蛋白的真蛋白质占粗蛋白质的比例只有45.42%和47.97%。说明从蛋白质质量角度讲,部分饲料真蛋白质含量较低,可能是影响饲料品质的一个重要因素。 相似文献
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气味结合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在菜粉蝶(Pieris rapae)气味识别的过程中发挥着重要作用。通过本地BLAST等方法在菜粉蝶基因组中找到了推测的OBPs和CSPs蛋白序列,采用多序列比对、半胱氨酸模式序列识别、进化发育树构建等方法,鉴定出了24个PrOBPs和38个PrCSPs基因。其中,PrOBP1-PrOBP17这17个OBPs属于Classic OBPs蛋白家族,PrOBP19-PrOBP24属于Minus-C OBPs蛋白家族。鉴定出的38个PrCSPs都具有鳞翅目CSPs的半胱氨酸模式识别序列。本实验通过对菜粉蝶基因组中OBPs和CSPs基因的查找鉴定,丰富了昆虫OBPs和CSPs基因数据库,可为菜粉蝶气味识别和化学感受相关实验和应用提供参考。 相似文献