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1.
本研究旨在建立显微注射转基因系统；获得表达人生长激素和猪生长激素基因的转基因兔和鼠；探索提高动物生长性能的可能性与可行性。家兔和小鼠作超数排卵和交配处理，收集原核胚。将小鼠金属巯因启动子与人生长激素和绵羊金属巯因启动子与猪生长激素融合的基因质粒注入雄原核，观察体外和体内发育结果。用斑点杂交、ＰＣＲ技术和放射免疫检测外源基因的整合和表达情况。试验结果，胚胎回收后立即作体外培养的囊胚发育率为９０％，基 相似文献
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把pMTSA,pHBV3.0,pSMGHI和pMDV38kdpp4种重组质粒,以单个或二者混合后经微注射导入家畜的受精卵,随后移入同种寄母,获得转基因家畜,兔导入上述外源基因的卵,移植后妊娠率59.70％(40/67),发育成个体率17.74％(129/727),整合率59.38％(57/96),在整合兔中有32.14％(9/28)表达;山羊,导入pSMGHI基因卵,移植后妊娠率50％(7/14)发育成个体率12.76％(12/94),整合率33.33％(4/12);牛,获一整合的流产胎儿。当代转基因兔的后代也检出整合的外源基因,并有部分表达,证明导入的外源基因是可以遗传的。研究表明,这一转基因系统具有相当的稳定性,并可应用家畜代替常规的生物反应器,生产具较高经济价值的蛋白质,为畜牧生产开辟了一条新途径。 相似文献
3.
【目的】双基因共整合可协同促进转基因生物的目的基因表达水平提高,研究获得rhPA/GH双转基因兔,并比较分析目的基因rhPA的表达水平及兔个体生长发育情况,为制备高表达rhPA转基因动物和遗传育种提供新思路。 【方法】利用NotⅠ/SalⅠ双酶切PCL25/GH质粒和QIAGEN DNA胶纯化试剂盒回收显微注射用基因片段。以3只rhPA单转基因兔（标号K06、K10、K17）作为供体兔,通过FSH/hCG超数排卵、受精卵原核显微注射、胚胎移植、苯酚/氯仿抽提新生仔兔耳尖组织基因组、PCR整合检测等方法获得rhPA/GH双转基因兔。经ELISA和Western blotting对转基因兔乳清进行表达检测,比较分析单、双基因表达rhPA水平。测量不同月龄的转基因兔体重,通过监测双转基因兔不同生长阶段的体重来分析GH对兔生长发育的影响。【结果】成功获得了约16 700 bp 大小的显微注射用基因片段,共超排3只供体兔获得122枚卵,其中103枚受精卵,受精率为84.4%（103/122）,显微注射后挑取形态较好的81枚移植6只同步发情受体兔,5只兔怀孕,妊娠率为83.3%（5/6）,妊娠到期共出生32只仔兔。通过PCR检测鉴定有19只携带rhPA基因的转基因兔,其中有11只rhPA/GH双转基因兔（7♂,4♀）,双基因整合率为34.4%（11/32）,且4只rhPA/GH双转基因母兔来源亲代分别为K06供体兔2只（标号K06-1、K06-2）、K10供体兔1只（标号K10-1）、K17供体兔1只（标号K17-1）。K06号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.2μg·mL-1,K06-1和K06-2号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量分别为432、444μg·mL-1;K10号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.8μg·mL-1,K10-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为636μg·mL-1;K17号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为15.2 μg·mL -1,K17-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为248 μg·mL -1。4只rhPA/GH双转基因母兔（K06-1、K06-2、K10-1、K17-1）乳腺表达rhPA含量在248-636μg·mL-1之间,远远高于rhPA单转基因母兔（K06、K10、K17）乳腺的表达含量（15.2-42.8μg·mL-1）,表达水平显著提高了约10.2-16.3倍,说明GH能够协同促进目的基因rhPA在转基因兔乳腺中的表达水平。Western blotting结果显示出现一约39.0 kD大小的条带,与目的蛋白rhPA大小相同,进一步证明转基因兔乳腺中表达的这种蛋白为目标产物rhPA。对rhPA/GH双转基因兔从出生到6个月的体重进行连续测量,发现与正常非转基因兔的体重没有明显的差异,绘制生长曲线进一步表明4只整合GH的转基因兔与2只未整合GH的正常兔在生长发育的不同阶段体重上没有显著性差异,成长至6个月的体重均在4.0-5.0 kg之间,这证明GH的导入并不影响转基因兔的存活和正常生长发育至成年。【结论】成功地制备了rhPA/GH双转基因兔,并证明了GH基因的导入能够显著地提高目的基因rhPA的表达量,且不会对转基因兔的生长发育产生影响,这为将来制备高表达转基因兔及其它动物奠定了基础,也为转基因动物乳腺生物反应器和转基因育种建立提供了新思路、新方法。 相似文献
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培育转基因动物的方法有多种,其中最普遍的方法有原核微注射法;反转录病毒感染分裂球法;DNA转化胚胎干细胞,然后注射到胚泡内法等。以精子作载体的基因转移是培育转基因动物的又一新方法。 相似文献
5.
通过微注射法将不同构型和不同剂量的全鱼基因（ｃＭＴｓＧＨ，鲤鱼ＭＴ启动子与大麻哈鱼ＧＨ基因）导入不同发育时期的鲫鱼受精卵，研究其孵化率；孵出鱼苗后．通过斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，研究其整合率；并对受精卵去壳与未去壳导入全鱼基因后比较其整合率。结果表明：１显微注射外源基因后以单细胞前、中期孵化率最高．与对照组比差异不显著（Ｐ＞０．０５）．与其它组比较差异极显著（Ｐ＜０．０１）；２．综合孵化率与整合率．外源基因导入的最佳时期是受精卵单细胞后期；３．去壳卵与非去壳卵注射外源基因后整合率差异不显著．但孵化率有显著差异（０．０１＜Ｐ＜０．０５）；４、外源基因整合率随着注射ＤＮＡ拷贝数的增加而增大．孵化率则相反：５．线性ＤＮＡ整合率高于环形ＤＮＡ整合率。 相似文献
6.
利用RT—PCR方法从人扁桃体的激活T细胞mRNA中扩增出诱导性免疫共刺激分子(ICOS)cDNA,继而将ICOS基因插入到pEGFP—N3中得到含ICOS和GFP融合蛋白的pEGFP—ICOS。将外源基因pEGF、P—ICOS注射至FVB小鼠原核中,其胚胎移植到同期发情的假孕受体产出后代,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。试验共注射移植胚胎117枚,出生小鼠43只,检出阳性小鼠2只,该转基因已稳定遗传至F3代,说明建立了ICOS转基因小鼠模型。 相似文献
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Xa21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
以成熟胚愈伤组织为转化受体 ,经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因 Xa2 1导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系 SWR2 0中 ,共获得 4 3个独立的转基因株系 ,1 0 0余株转基因水稻植株。经 GUS活性、潮霉素抗性检测及PCR分析表明 ,外源基因已整合到转基因水稻基因组中 ;白叶枯病原菌接种试验表明 ,大部分 T0 代转基因水稻植株的抗病性有明显提高 ,多数植株表现抗或高抗 ,个别为感病。经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后 ,GUS瞬间表达率可高达 92 .5% ,稳定转化频率达到 2 7.6% 相似文献
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将人类MCP(膜辅因子蛋白)和CD59(终末阶段同源限制因子)两种基因采用混合注射的方法,导入521枚昆明小鼠的受精卵原核中,得到原代转CD59基因小鼠14只,CD59的整合率为18.4%;转MCP基因小鼠12只,MCP的整合率为15.7%;转CD59 MCP双基因小鼠7只,双基因整合率为9.2%;转基因效率5%。通过5只存活的G0代转双基因小鼠和非转基因小鼠的繁殖,得到F1代转MCP小鼠14只,转CD59小鼠16只,转双基因小鼠10只;F1代双基因占33.3%。 相似文献
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睾丸注射Mx基因生产抗病转基因鸡初探 总被引：2，自引：1，他引：1
采用脂质体转染法,将线性化pcDNA3.0-MMx质粒随机打点注射入18周龄青年公鸡睾丸内,术后观察公鸡日常活动、常规检测精子;采集转染后25、50、75 d公鸡精液,并于转染70 d后人工采精,授精于正常母鸡,产生F1后代,采用常规PCR检测技术,检测证实外源Mx基因的整合情况,探讨外源Mx基因在鸡体内稳定整合和遗传的能力。结果表明:手术法转染外源基因过程对公鸡的生殖功能未造成明显影响;PCR检测证实外源Mx基因已整合到精子基因组,且能通过体外受精传递给后代,后代PCR检测的阳性率为27.27%(6/22)。证明外源Mx基因能稳定整合到基因组上,睾丸内注射法可能是一种切实可行、易于推广的制备抗病转基因鸡的方法。 相似文献
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以成熟胚愈伤组织为转化受体，经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因Xα21导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系SWR20中，共获得43个独立的转基因株系，100余株转基因水稻植株，经GUS活性，潮霉素抗性检测及PCR分析表明，外源基因已整合到转基因水稻基因组中，白叶枯病原菌接种试验表明，大部分T0代转基因水稻植株的抗病性有明显提高，多数植株抗或高,抗，个别为感病，经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后，GUS瞬间表达率可高达 92．5％，稳定转化频率达到27．6％。α 相似文献
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移植方法和培养液对显微注射生产转基因小鼠的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
研究了移植方法和培养液对显微注射法生产转基因小鼠的影响。结果表明 ,小鼠受精卵显微注射外源基因后 ,进行单、双侧输卵管移植 ,受体的妊娠率分别为 34.4 %和 37.5 % (P>0 .0 5 ) ,差异不显著 ;但仔鼠成活率分别为 83.6 %和 97.2 % (P<0 .0 5 ) ,差异显著。用 M2和改良的 M2培养液作为显微注射及移植工作液 ,体外培养的囊胚率分别为 17%和 35 % (P<0 .0 1) ,差异极显著 ,体内发育的情况也与这一结果相似 ,妊娠率分别为 35 .9%和 6 2 .5 % (P<0 .0 5 )。表明改良的 M2培养液的成分结构更适合小鼠胚胎发育的要求。 相似文献
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目的:建立可表达血清淀粉样P成分(SAP)转基因小鼠模型,以研究SAP基因的功能。方法:采用基因重组技术将SAP基因插入到pCMV-Tag5A真核表达载体上。经BciVI限制性内切酶酶切后,琼脂糖凝胶电泳回收2.7 kb目的片断,受精卵原核显微注射法将其注入雄原核,制备转基因小鼠。采用PCR法在基因水平筛选SAP转基因小鼠阳性小鼠;免疫沉淀法结合免疫印迹法在蛋白水平检测SAP基因在PCR阳性转基因小鼠中的表达情况。结果:成功构建了pCMV-Tag5A/mSAP真核表达载体。经显微注射法将2.7 kb线性目的基因片断注射入受精卵雄原核,移植入代孕母鼠,所生127只小鼠,其中PCR鉴定获得10只转基因阳性小鼠。免疫沉淀法和免疫印记法随机检测83#♂founder、7#♀founder与C57 BL/6J小鼠回交F1代PCR阳性转基因小鼠血清中外源SAP基因蛋白水平的表达,发现均有表达。结论:该研究以C57BL/6J小鼠为研究对象,成功地产生能稳定遗传SAP基因的过表达转基因小鼠模型,它将有利于研究SAP基因在炎症、淀粉样沉淀、自身免疫系统中的作用。 相似文献
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Microinjected c-myc as a competence factor 总被引：54，自引：0，他引：54
L Kaczmarek J K Hyland R Watt M Rosenberg R Baserga 《Science (New York, N.Y.)》1985,228(4705):1313-1315
While a number of oncogenes are expressed in a cell cycle-dependent manner, their role in the control of cell proliferation can only be established by a direct functional assay. The c-myc protein, upon microinjection into nuclei of quiescent Swiss 3T3 cells, cooperated with platelet-poor plasma in the stimulation of cellular DNA synthesis. This suggests that c-myc protein, like platelet-derived growth factor (PDGF), may act as a competence factor in the cell cycle to promote the progression of cells to S phase. The presence in the medium of an antibody against PDGF abolished DNA synthesis induced by microinjected PDGF; however, the microinjected c-myc protein stimulated DNA synthesis even when its own antibody was present in the medium. The c-myc protein may act as an intracellular competence factor, while PDGF expresses its biological activity only from outside the cells. 相似文献
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为了优化转基因小鼠的制备技术,试验着重对注射DNA的制备、高质量受精卵的获得、显微注射、胚胎移植及早期胚胎检测等各步骤中的主要影响因素进行了优化。移植后出生的小鼠经PCR及Southern Blot检测,阳性鼠检出率由1.85%(2/108)增加到23.36%(25/107)。由此说明,通过注射DNA的改良、技术优化以及GFP在转基因动物中的应用,转基因效率可以得到明显提高,为高效制作转基因动物提供基础。 相似文献
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A procedure has been developed for introducing exogenous DNA into mouse eggs by injection of chromosome fragments. Chromosome fragments were dissected from human metaphase spreads and microinjected into the pronuclei of fertilized mouse eggs. Many of the injected eggs subsequently exhibited normal pre- and postimplantation development. Embryos obtained from eggs injected with centromeric fragments retained human centromeric DNA as demonstrated by in situ hybridization analysis. From eggs injected with noncentromeric fragments, a mouse was obtained whose tail tissue exhibited the presence of human DNA. This procedure should facilitate incorporation of very large (more than 10 megabases) DNA fragments into cells and embryos without the need for cloned sequences. 相似文献
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取小鼠原核(220枚)、2～4细胞胚胎(227枚)、桑椹胚(127枚),将其分为3组,每一时期胚胎分成两半,一半取出后立即冷冻复苏并体外培养至囊胚,另一半体外培养至囊胚后冷冻复苏,子宫冲取囊胚(78枚)冷冻复苏为对照组;各组囊胚均移植至于宫,比较程序化冷冻对小鼠早期胚胎存活率的影响.结果表明:原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚体外培养至囊胚后冷冻复苏率分别为56.4%、72.2%、81.6%,移植产仔率分别为38.1%、41.6%、56.8%,原核、2～4细胞组复苏率和产仔率极显著或显著低于对照组,桑椹胚组与对照组差异不显著,显示体外培养对早期胚胎冷冻存活有影响;原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚冷冻后体外培养至囊胚,胚胎移植后产仔率分别为25.3%、28.2%、42.1%,与对应胚胎时期体外培养至囊胚冷冻复苏后移植产仔率相比,原核、2～4细胞组均存在显著差异,而桑椹胚组差异不显著,显示原核、2～4细胞的早期胚胎体外培养至囊胚后冷冻可提高冷冻存活率. 相似文献
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Transmission of integrated sea urchin histone genes by nuclear transplantation in Xenopus laevis 总被引：3，自引：0，他引：3
Sea urchin histone genes contained in a recombinant plasmid pSp102 were microinjected into the cytoplasm of fertilized eggs of Xenopus laevis. By the late blastula stage, plasmid DNA sequences were detected comigrating with the high molecular weight cellular DNA (greater than 48 kilobases). Analysis of the DNA from injected embryos digested with various restriction endonuclease demonstrated that the injected DNA was integrated into the frog genome. Clones of embryos containing the pSp102 DNA sequences were produced by means of nuclear transplantation. Individuals of the same clone contain the pSp102 sequences integrated into similar chromosomal locations. These sites vary between different clones. 相似文献
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[目的]为转基因猪生产的整合效率、外源目的基因表达水平、目的基因在猪体内组织特异性表达分布等相关领域的进一步研究奠定基础。[方法]用显微注射法将GFP标记的转基因猪表达载体PM1导入湖北白猪和通湖猪1-细胞、2-细胞胚胎中,胚胎移植妊娠后生产仔猪,取耳或尾组织样提取基因组总DNA,用PCR法检测PM1在猪基因组中的整合情况。[结果]在所有生产的78头仔猪中,有6头猪用PCR检测为转PM1基因阳性猪,这6头猪在3次PCR扩增反应中都得到650 bp目的扩增片段。其他样品没有得到目的扩增片段的为阴性猪。[结论]载体PM1可以用于携带外源基因进行转基因猪生产。 相似文献