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1.
利用BrdU在CEF(TK~ )细胞中筛选TK~-重组鸡痘病毒 总被引：1，自引：0，他引：1
将新城疫病毒 (NDV)四平株 HN基因 ,插入不含报告基因、以 TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2中的复合启动子下游 ,获得重组表达质粒 p UTA- 2 HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,培养、收获病毒后 ,用含 40 m g/ L 5 -溴 - 2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U )的培养液 ,在 CEF(TK )细胞中筛选培养 2代 ,然后用不含 Brd U的培养液进行病毒蚀斑纯化 ,成功筛选出表达 NDV HN蛋白的 TK-重组鸡痘病毒 相似文献
2.
将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。 相似文献
3.
分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。 相似文献
4.
将含痘病毒启动子LP2EP2的鸡传染性支气管炎病毒S1糖蛋白基因和鸡IL-18(ChIL-18)基因同时插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组禽痘病毒转移载体pSYS1/ChIL-18。用脂质体将其转染已感染禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达S1和鸡IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-S1-ChIL-18)。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,对重组病毒rFPV-S1-ChIL-18进行多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用S1基因和鸡IL-18基因特异引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb和1条约0.6 kb的带。经间接免疫荧光法和T细胞转化试验证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中存在表达的S1和鸡IL-18。 相似文献
5.
以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
6.
禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达 总被引：6，自引：2，他引：4
为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。 相似文献
7.
将含新城疫病毒 (NDV)四平株 F基因的重组质粒 (p KSF)经 Eco R 及 Xba 双酶切 ,回收 340 bp的 c DNA片段 ,制备了地高辛标记的 c DNA探针。特异性检测表明 ,该探针对含 NDV F基因的 p KSF呈现特异性 ,而对照载体质粒及鸡痘病毒 (FPV 2 82 E4 )的核酸均呈阴性 ;敏感性检测表明 ,该探针对同源 DNA的检出限量为 4 0 pg。应用该探针对含 NDV F基因的重组鸡痘病毒 v FV2 82进行杂交检测 ,结果呈阳性。以上结果表明 ,该探针可成功用于含 NDV F基因的重组鸡痘病毒的鉴定 相似文献
8.
将禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中，构建重组转移载体pSY（NA＋LacZ），将其转染鸡胚成纤维细胞，经蓝白斑筛选，纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA，用其免疫SPF鸡，检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示，该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白，表达产物的分子质量约为55ku；用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后，能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明，重组禽痘病毒rFPV—NA具有良好的免疫原性。 相似文献
9.
将鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）gD基因和鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因通过同源重组法重组禽痘病毒转移载体,构建含ILTVgD基因和ChIL-2基因的重组禽痘病毒转移载体rFPVIL2ILTV—gD,蓝色蚀斑纯化法纯化重组病毒,用IFA检测重组病毒中ILTVgD基因的表达和用ELISA试剂盒检测ChIL-2的表达。重组病毒rFPV—IL2-ILTV-gD免疫试验鸡,间接ELISA测定血清中ILTV抗体效价,动物试验用构建的ILTV强毒以滴鼻方式攻击各组试验鸡,结果表明,外源基因在重组禽疽病毒中得到了稳定表达;ELISA检测结果表明在免疫7d后能够检测到血清抗体,免疫21d后血清抗体达到高峰,此后便开始逐渐下降,符合疫苗免疫的消长规律;攻毒后每组鸡的发病情况可以看出重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组和疫苗对照组对ILTV强毒攻击的保护率分别为96％和92％,而空白对照组为8％。说明构建的重组病毒rFPV-IL2-ILTV—gD免疫效力稍优于弱毒疫苗,能够较好的保护免疫鸡群。 相似文献
10.
根据文献设计2对引物,PCR扩增FPV复制非必需区中外源基因插入位点两侧翼的片段,分别克隆到pUC19和pSK质粒中,并命名为pFP1和pFP2。根据文献设计引物,PCR扩增鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因的编码区。将GB基因克隆到质粒pFP1中获得重组质粒pFP1-GB;用酶切质粒pEGFP,得到GFP片段并克隆到质粒pFP2中,得到重组质粒pFP2-GFP。双酶切pFP1-GB得到FP1-GB片段,并克隆到质粒pFP2-GFP中,得到重组质粒pFP1GB-FP2GPF。酶切质粒pE/L-7.5,获得背向连接的2个鸡痘病毒启动子片段——PE/L-7.5,并将该片段克隆到重组质粒pFP1GB-FP2GPF获得重组质粒pGB-GFP,该质粒即为鸡痘病毒的转移质粒。在质粒pGB-GFP中,2个背向连接的启动子被克隆到的GB和GFP基因之间,分别启动GB和GFP基因的表达。经酶切和测序鉴定pGB-GFP,启动子PE/L和P7.5已分别正确地插入到GB和GFP基因之间,分别启动外源表达基因GB和筛选标记基因GFP的表达,从而证明已获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体pGB-GFP。该载体为下一步获得表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒奠定基础。 相似文献
11.
为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。 相似文献
12.
禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联没乳剂灭活疫苗的研制 总被引：1，自引：0，他引：1
以禽流感病毒（AIV）H5N4株，新城疫病毒（NDV）LaSota株与传染性支气管炎病毒（IBV）M41株为抗原研制了AI－ND－IB三联油乳剂灭活疫苗，并对疫苗的物理性状，安全性，免疫效力，保存期及抗体消长规律进行了检测，结果表明，疫苗在免疫后3周后6个月内，对AIV－H5N4，NDV－北京株的攻击均获全部保护，在免疫后52周内，免疫鸡箅清中AIV－N5N4，MDV，IBV的HI抗体也保持较高的水平，疫苗在4℃保存15个月，其免疫力没有下降。 相似文献
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鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。 相似文献
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肉种禽网状内皮增生症、鸡传染性贫血和禽白血病血清学调查 总被引：13，自引：0，他引：13
对不同种鸡场不同周龄肉种鸡进行REV、CAV和ALV（A、B亚群）抗体检测。在572份血清样品中，除了一个8．1周龄和15周龄鸡群CAV抗体阳性率分别为13．3％和75％外，其它鸡群无论是否进行CAV疫苗免疫，抗体阳性率均为100％。在212份血清样品中，REV抗体阳性率在16．7％～62．5％之间；ALV（A、B亚群）抗体阳性率在0％～75％之间。本研究结果表明，所检测种鸡群中存在3种免疫抑制性病毒的感染或混合感染。 相似文献
15.
WANG Song ZENG Hao CHEN Zhi JIAO An-qi ZHANG Shu-jin YU Jiang SUN Wen-bo ZHANG Yu-yu CHEN Lei DU Yi-jun LI Jun WU Jia-qiang WANG Jin-bao 《中国畜牧兽医》2017,44(7):2165-2170
To understand porcine viral diarrhea prevalence in the large-scale pig farms of Shandong province, a total of 3 035 clinical samples were detected by PCR from January, 2014 to December, 2016.Those samples were detected for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and pseudorabies virus (PRV). The results showed that the detection rate of PEDV, PRV and TGEV were 67.49%, 9.33% and 3.29%, respectively.During the past three years, the lowest detection rate of PEDV was 48.15% in the fourth quarter of 2014,and the highest was 88.57% in the fourth quarter of 2015.In 2016,the detection rate represented fluctuate declining compared with 2015.The highest positive rate of TGEV was 18.52% in the fourth quarter of 2014,and in the third quarter of 2015 was 15.38%.The lowest positive rate of TGEV was 6.67% in the first quarter of 2016 and TGEV was not detected in the other quarters. The highest detection rate of RPV was 15.68% in the second quarter of 2016,and the lowest was 2.56% in the second quarter of 2014,except the first quarter of 2014 that the PRV was 0. By detecting three kinds of viruses in 69 clinical samples collected passively, the results showed that the detection rate of PEDV,TGEV and PRV were 86.96%,5.80% and 37.68%,respectively. The total single infection rate was 69.57%,the single infection rates of PEDV,TGEV and PRV were 57.97%,1.45% and 10.14%, respectively;The total mixed infection rate was 30.43%,the mixed infection rates of PEDV/PRV,PEDV/TGEV and TGEV/PRV were 26.09%,2.90% and 1.45%, respectively;Obviously, the total single infection rate was higher than the total mixed infection rate. The results showed that the PEDV, PRV and TGEV were prevailing in Shandong province. There were PEDV/TGEV, TGEV/PRV, PEDV/PRV mixed infection, and the number of PEDV/PRV mixed infection was in the majority. However, there was no PEDV/PRV/TGEV mixed type infection. At present, PEDV was the major pathogen of porcine viral diarrhea and the test results could provide the reference to the diagnosis of porcine viral diarrhea. 相似文献
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为了解山东省规模化猪场由猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪伪狂犬病毒（PRV）引起猪病毒性腹泻的流行情况,自2014年1月至2016年12月,对来自山东省各地规模化猪场的猪腹泻病料（共3 035份）进行PCR检测。结果显示,PEDV、PRV和TGEV阳性率分别为67.49%、9.33%和3.29%;3年间,PEDV阳性率在2014年第四季度最低,为48.15%,2015年第四季度阳性率最高,为88.57%,2016年各季度阳性率相对2015年呈波动下降趋势;TGEV阳性率在2014年第四季度最高,为18.52%,2015年第三季度阳性率为15.38%,2016年第一季度阳性率为6.67%,其他季度未检测出阳性病料;PRV阳性率在2016年第二季度最高,为15.68%,除2014年第一季度未检出阳性病料外,2014年第二季度阳性率最低,为2.56%。通过对69份被动送检的病料进行PEDV、TGEV和PRV混合感染检测发现,这部分病料中PEDV、TGEV、PRV阳性率分别为86.96%、5.80%和37.68%;总单独感染率为69.57%,PEDV、TGEV和PRV单独感染率分别为57.97%、1.45%和10.14%;总混合感染率为30.43%,PEDV/PRV、PEDV/TGEV和TGEV/PRV混合感染率分别为26.09%、2.90%和1.45%;总单独感染率比总混合感染率高。结果表明,山东省存在PEDV、PRV和TGEV 3种病毒流行,存在PEDV/TGEV、TGEV/PRV和PEDV/PRV的混合感染,混合感染中主要为PEDV/PRV混合感染,不存在PEDV/PRV/TGEV的混合感染。目前PEDV是引起山东省猪病毒性腹泻的主要病因,本试验结果可为山东省猪病毒性腹泻的诊断和控制提供参考。 相似文献
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将马立克氏病病毒gB基因用EcoR I从质粒pUR-MDVEgB中切下。两端补平后，插入到质粒pEFgpt12s的Pst I酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s-gB。这个载体的特点是，它含有两个启动子，在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因，另一个反向启动子vvP7.5的下游 是标记基因Ecogpt，它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s-gB通过磷酸钙的方法转染用282e4株FPV感染3-4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选 ，得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测，证实了重组病毒中含有gB基因，并且gB糖蛋白也得到了表达。 相似文献
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禽网状内皮组织增生病病毒和马立克氏病病毒共感染对鸡的致肿瘤作用 总被引：6，自引：3，他引：6
用禽网状内皮组织增生病病毒(REV)和马立克氏病病毒(MDV)共感染肉鸡，研究这2种病毒对鸡的致瘤作用，结果表明肉鸡共感染MDV和REV后13d即可发生死亡．接种后100d死亡率达84％。死亡鸡的肝脏、脾脏、肾脏和心脏等可以形成2种外观明显不同的散在的大肿瘤结节和弥漫性的小肿瘤结节。取发病鸡的肝脏、脾脏、肾脏、心脏和腺胃等组织样品做连续石蜡切片，HE染色后发现这些脏器均存在2种不同类型的肿瘤细胞增生。对这些连续切片分别用MDV和REV的单克隆抗体进行间接荧光试验，则同1份样品存在可以与REV和MDV分别呈现阳性反应的肿瘤细胞团，结果表明REV和MDV可以在感染鸡的体内分别诱发形成肿瘤。在接种后14、21、28和42d随机采集3只鸡的全血分离MDV和REV，均可以同时分离到MDV和REV。表明REV和MDV的共感染延长了病毒血症的时间。 相似文献
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塞内卡病毒A（SVA）与口蹄疫病毒（FMDV）引起猪的临床症状难以区分,并且以SVA作为载体插入FMDV抗原表位外源基因的研究,目前还没有报道。为了构建一种嵌合FMDV抗原表位的重组SVA毒株并进行鉴定,本研究利用基因克隆技术将O型FMDV的B细胞表位与白蛋白信号肽（human albumin signal peptide,HAS）基因串联插入到SVA基因组中,成功构建了重组质粒,转染细胞后拯救出重组病毒rSVA-HAS-OB。结果显示：RT-PCR扩增与基因测序结果表明目的基因正确插入;细胞间接免疫荧光和Western blot鉴定了嵌合抗原蛋白的有效表达;遗传稳定性分析表明重组病毒在25代次的传代过程中仍稳定存在B细胞表位;病毒蚀斑表型和一步生长曲线结果表明,重组病毒与亲本毒株具有相似的增殖特性。本研究成功构建并拯救出能够表达FMDV抗原表位的重组SVA毒株,为以SVA为基础的嵌合病毒及疫苗的研究提供了理论和实验基础。 相似文献
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山羊痘病毒和羊口疮病毒双重PCR检测方法的建立与初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
根据GenBank发表的山羊痘病毒（goatpox virus,GPV）和羊口疮病毒（orf virus,ORFV）基因序列,分别合成针对GPV ITR和ORFV H2L基因片段的2对引物,以GPV和ORFV的核酸混合物作为模板,经优化反应条件,成功建立了快速鉴别检测GPV、ORFV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对GPV与ORFV核酸的扩增能获得289和507 bp的特异性目的片段,而对FMDV、FPV、BTV、健康山羊皮肤的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4 pg,对ORFV核酸为0.4 pg;对临床采集的12份病料进行双重PCR扩增,GPV检出率为25%（3/12）,ORFV的检出率为75%（9/12）。结果表明,建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和ORFV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。 相似文献