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农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化技术流程及操作要点 总被引：1，自引：1，他引：0
大豆遗传转化效率低,是大豆转基因育种亟待解决的重要问题。以大豆子叶节为外植体采用农杆菌介导法,系统地研究了大豆子叶节遗传转化各技术环节的操作要点,包括工程菌液制备、无菌苗获得及外植体制备、农杆菌的侵染及共培养、不定芽诱导、不定芽伸长、根诱导、驯化与移栽、抗性植株的获得及转基因植株的检测等,建立了一套较稳定、高效的大豆子叶节遗传转化体系。并利用该体系,将野生大豆耐盐碱相关基因A1对大豆品种绥农28、合丰50、合丰55、东农50进行遗传转化,系统地探讨了大豆基因型、影响T-DNA的转移效率的各环节、筛选剂浓度及不同基因型转化效率等几个重要因素。 相似文献
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以MYB转录因子AtPHR1表达载体为转化对象,采用农杆菌介导子叶节转化技术将其转入栽培大豆,研究不同萌发时间、预培养时间、菌液和侵染液浓度、大豆基因型以及筛选剂浓度对转化效率的影响.结果表明:以萌发5d大豆幼苗制备子叶节外植体,预培养1d,农杆菌菌液OD600为0.7,侵染液OD600为0.5或0.7进行转化,100 mg.L-1卡那霉素进行筛选的抗性芽诱导率最高;5个供试品种中,以五星2号的转化率最高,约为2.0％;经PCR检测转化后的大豆植株,获得了含有转录因子AtPHR1的5个大豆新材料. 相似文献
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以丛生芽率为指标,将农杆菌介导的大豆未成熟种子子叶节转化与成熟种子转化体系进行比较,明确了诱导过程中草甘膦筛选浓度、未成熟种子生理状态,改进大豆外植体的获得方式并减少了组培环节,建立了未成熟种子子叶节转化体系。利用Jack黄熟后期的种子作为受体材料,在15 mg·L-1的草甘膦筛选浓度下获得了9株PCR检测阳性植株并且生长正常可育,T0代经测序及Southern Blot分析,进一步证明外源基因已整合进大豆基因组中,其中2个株系的T1代植株经PCR检测符合3∶1的分离比,且表型鉴定筛选出抗性转基因植株,为抗草甘膦转基因大豆育种提供了新材料。 相似文献
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构建含有Bt(cry Ⅰ A)基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Bt,以大豆子叶节为受体,通过农杆菌介导法将Bt基因导人大豆品种黑农37中,获得转基因植株.并进行人豆的再生和遗传转化系统优化的研究,以获得较高的转化率.结果表明:在6-BA浓度为1.7 mg·L-1时,丛生芽分化率最高,确定该品种大豆在从生芽分化阶段的草铵膦筛选浓度为3.5 mg·L-1获得转化质粒pCAMBIA3300-Bt的转基因植株,其中T1代PCR阳性植株19株.采用real-time PCR的方法对T1代抗性植株进行Bt基因的转录水平的分析,初步证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内. 相似文献
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《大豆科学》2015,(4)
选用内切酶SacⅠ和MluⅠ切割目标基因和载体,构建了携带bar基因的重组载体p BA002-Gm AOC3,选用2个大豆品种(Jack和南农88-1)和2种外植体(子叶节和整个子叶节),研究大豆品种和外植体对根癌农杆菌介导的子叶节转化Gm AOC3基因的影响。结果表明:外植体为整个子叶节的大豆品种Jack的出芽率和转化率最高,分别为79.5%和2.27%。经Quick Stix PAT/bar基因试纸条检测、目标基因的分子检测和草丁膦抗性鉴定,共得到转Gm AOC3基因的T0代阳性株系3株,T1代阳性转基因大豆6株,其中5株以Jack品种为受体的转基因大豆Gm AOC3基因的表达量均显著高于非转基因植株,荧光定量拷贝数检测结果显示,4株转基因单株为单拷贝,2株为双拷贝。 相似文献
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一种简便大豆原位转基因方法研究 总被引：2，自引：0，他引：2
以萌发大豆幼苗顶芽为外植体,经纵切及农杆菌侵染后种植到大田中,转化植株用除草剂进行表型鉴定,存活植株进行PCR验证,并分析目的基因EPSPS在T2代转基因植株中的遗传情况;总计获得草铵膦涂抹表型鉴定阳性T0植株75株,草甘膦喷雾鉴定阳性T1植株65个,PCR测序阳性T1植株6个,PCR测序检测转化效率为0.14%;获得T2代PCR阳性植株52个,初步证明目的基因EPSPS能在子代中遗传;该方法能有效解决基因型依赖及再生植株困难等问题,缩短转化周期,为根癌农杆菌阶段的大豆遗传转化体系的优化与改良提供了参考。 相似文献
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农杆菌介导法将Bt（cryI4）基因导入大豆的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
构建含有Bt（cryIA）基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Bt，以大豆子叶节为受体，通过农杆菌介导法将Bt基因导入大豆品种黑农37中，获得转基因植株。并进行大豆的再生和遗传转化系统优化的研究，以获得较高的转化率。结果表明：在6-BA浓度为1．7mg·L^-1时，丛生芽分化率最高。确定该品种大豆在丛生芽分化阶段的草铵膦筛选浓度为3．5mg·L^-1。获得转化质粒pCAMBIA3300-Bt的转基因植株，其中T1代PCR阳性植株19株。采用real—timePCR的方法对T4代抗性植株进行助基因的转录水平的分析，初步证明成基因已整合到受体大豆的基因组内。 相似文献
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根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立农杆菌介导的大麦茎尖遗传转化技术,以我国大麦主推品种鄂大麦9号、鄂大麦32122为材料,以农杆菌介导法转化大麦茎尖,经PPT筛选获得了转抗除草剂基因的大麦株系。PCR鉴定表明,以鄂大麦9号茎尖为受体,筛选获得4个转基因植株,阳性率为0.59%;以鄂大麦32122茎尖为受体,筛选获得10个阳性植株,阳性率为1.96%。转基因T1代Southern杂交分析证实,外源基因确已整合到大麦基因组中,已鉴定的转基因株系均含单个转基因拷贝,不同转基因株系整合的位点不同。因此大麦茎尖可作为农杆菌转化的受体。本研究结果为拓宽大麦遗传转化受体提供了技术和方法。 相似文献
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《Journal of Crop Improvement》2013,27(1-2):27-50
Abstract Ornamental plant transformation has advanced considerably in the last decade. Now over 40 genera have been reported to be transformed. The primary methods of creating transgenic ornamental species have been Agrobacterium tumefaciens-medmtedtransformation and microprojectile bombardment. The vast majority of reports indicate the use of Agrobacteriummedmtedtransformation employing binary vectors and virhelper plasmids or supervirulence genes. Many reports are of transformation with the uidA reporter gene driven by the 35S cauliflower mosaic virus promoter, but recent efforts are now focusing on trait genes including disease resistance, flower color, flower longevity, floral scent and plant habit. Greater use of tissue specific and inducible promoters promises to enhance the functionality and usefulness of introduced trait genes. While technical challenges for production of transgenic ornamental plants still exist, the greatest challenges to realizing the potential benefits of transgenic ornamental plants are questionable public acceptance of transgenic plants and the prohibitive costs of generating environmental impact data needed to gain regulatory clearance. 相似文献
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农杆菌介导的大豆植株整体转化 总被引：1，自引：0，他引：1
农杆菌介导的植物整体转化法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导人的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代.以大豆幼苗的顶端生长点和叶腋生长点为靶点,通过农杆菌介导的整体转化法--注射法进行转录因子DREB1C基因的遗传转化,最终获得6株T0代PCR阳性转基因植株,转化率为9.2%.T1代植株的PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定结果表明获得1株阳性植侏,DREB1C基因以单拷贝形式整合于大豆基因组中,在200 mmol·L-1NaCl胁迫条件下在转录水平得到成功表达.该方法克服了大豆组织培养再生难、转化率低的缺点,是一种高频、简单、快捷的非组培遗传转化途径. 相似文献
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提高稻瘟病菌转化频率的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
为提高pAN7-1质粒导入稻瘟病菌建立的遗传转化体系的转化率，进行了对转化效率影响因子的研究。稻瘟病菌转化溶液中使用50 mmol/L CaCl2浓度，PEG4000 40%或PEG80000 40%多聚物，添加30 μg鲱鱼精DNA，供体质粒DNA呈直线状都有利转化频率的提高。其中鲱鱼精DNA作用尤为显著，由于添加30 μg鲱鱼精DNA，转化频率高达71.6转化子/μg DNA。42℃热冲击对稻瘟病菌转化并非必需，转化溶液中添加受体菌2539w DNA后，反而引起转化频率的明显下降。 相似文献
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1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化水稻的研究 总被引：14，自引：0，他引：14
摘要：PCR和Southern blotting检测表明,来自大肠杆菌的[i]mtlD[/i]基因已通过农杆菌介导整合进水稻基因组。[i]mtlD[/i]基因在T1代出现分离, T2代出现纯系。在0.75% NaCl胁迫下,7个转基因T3代株系都能检测到mtlD酶活性,与对照相比细胞膜的相对电导率和大分子渗漏值明显降低。部分转基因株系能在 1.0% NaCl浓度下正常生长,而对照在0.5% NaCl浓度下已不能存活。通过有性杂交途径实现了[i]mtlD[/i]和[i]gutD[/i]两个基因的聚合,部分杂交后代株系能在1.25%NaCl胁迫下正常生长结实。 相似文献
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核酶基因转化番木瓜的研究 总被引：19，自引：0，他引：19
利用酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ,Ｒｉｂ．）基因转化番木瓜（Ｃｗａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ．）探索培育抗番木瓜环斑病毒（Ｐａｐａｙａ Ｒｉｎｇｓｐｏｔ Ｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）品种的新途径。用三亲交配法将切割ＰＲＶ ＲＮＡ的Ｒｉｂ,基因的表达载体（Ｐ３５ｓ／ＮＰⅡ,Ｒｉｂ）,转入农杆菌ＬＢＡ４４０４,采用农杆菌介导转化将Ｒｉｂ,,基因和ＮＰＴⅡ基因导入番木瓜细胞的核基因组中。其培养的外植体在含有Ｋａｎ．１０ 相似文献
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香蕉茎尖遗传转化法研究 总被引：20，自引：2，他引：18
通过对多茎尖繁殖方法和转基因研究,建立了香蕉茎尖外源基因的遗传转化方法。明确了卡那霉素或Ｇ－４１８在转化植株中所使用的合适浓度,即当使用卡那霉素时,其产梢的浓度为１００ｍｇ／Ｌ,导根的浓度为１５０ｍｇ／Ｌ;但当使用Ｇ－４１８时,其产梢浓度则为２５ｍｇ／Ｌ其导根浓度则为３０ｍｇ／Ｌ或３５ｍｇ／Ｌ。通过基因枪和农杆菌共培养法尝试将黄瓜花叶病毒的衣壳蛋白基因转化香蕉组织,其结果表明：经过卡那霉素或Ｇ－４１８的筛选,仅有５％～７％的芽能够存活下来。通过选择性继代培养,最后获得了７３株株转化植株;对其中的２４株进行ＰＣＲ检测,结果表明阳性率达８３．３％;进一步的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明：ＰＣＲ检测阳性的８１．８％植株含有外源衣壳蛋白基因。 相似文献
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《水稻科学》2017,(3)
The floral-dip transformation, the simplest technique, is no requirement of tissue culture procedure, and can directly transfer the interest gene into plant reproductive cells. It has been successfully applied to various plant species. In this study, the optimal conditions of a floral-dip method for production of transgenic rice variety RD41 were explored. The simple and effective inoculation medium was composed of Murashige and Skoog(MS) medium, 5% sucrose, 44 nmol/L benzylaminopurine, and 0.075% surfactant Tween-20 with pH 5.7. The transformation efficiencies of Agrobacterium tumefaciens strains AGL1 and EHA105 were compared with the Agrobacterium density at OD_(600) = 0.8–1.0 and the co-cultivation at 25 ℃ for 48 h. A. tumefaciens strain EHA105 gave slightly higher transformation efficiency than AGL1, with statistically non-significant difference. The floral-drop transformation using the optimal floral-dip conditions showed higher transformation efficiency than the floral-dip method, but the dropped flowers turned brown and died within 2 d. Production of transgenic rice variety RD41 by the floral-dip method was achieved using A. tumefaciens strain EHA105 with the optimal conditions. Screening for the gus A gene by PCR using the gus A specific primers in the T_0 lines, there were 4 transgenic lines from 286 T_0 lines(1.4% transformation efficiency). However, histochemical glucuronidase(GUS) assay demonstrated that only three of four transgenic lines exhibited gus A expression. These results indicated that floral-dip transformation is a potential tool for production of the transgenic rice, which can be used for molecular breeding via genetic engineering in the future. 相似文献