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少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因AO-190的克隆、表达及其酶活性的测定 总被引：1，自引：0，他引：1
捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌在侵染线虫的过程中分泌几丁质酶,为了弄清少孢节丛孢菌几丁质酶基因AO-190的分子特征和功能,对少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1几丁质酶AO-190进行克隆及分子特征分析,构建原核表达载体p ET32a-AO-190进行表达,并利用镍柱纯化技术纯化重组几丁质酶后,使用几丁质酶ELISA检测试剂盒测定酶活性。结果显示,XJ-A1几丁质酶AO-190基因全长1 574 bp,有4个内含子序列,序列中包含1个1 251 bp的开放阅读框(ORF),编码416个氨基酸,与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)的几丁质酶AO-190基因序列的同源性为93. 33%,氨基酸序列的同源性为92. 55%;有信号肽以及1个精氨酸富集区、1个双向核定位信号、1个N-糖基化位点、4个PKC磷酸化位点、6个N-酰基化位点、8个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酰胺化位点、1个低复杂度区,且含有糖苷水解酶18家族几丁质酶保守的底物结合位点SLGG和催化活性位点VDGVDLDLE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶;其二级结构元件有无规则卷曲、α螺旋和β折叠,三级结构为(α/β)8圆桶形结构;系统进化分析表明,AO-190与能产生短柄黏球的Dactylellina haptotyla的几丁质酶(EPS43772. 1)以及能产生收缩环的Drechslerella stenobrocha(EWC46603. 1)几丁质酶亲缘关系最接近,与昆虫和脊椎动物的几丁质酶存在显著的进化距离;经SDS-PAGE和Western Blot分析,原核表达获得的重组蛋白酶分子量约为63 ku,与预期大小一致,且能与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性血清学反应;几丁质酶酶联免疫分析(ELISA)检测,经镍柱纯化技术纯化后的重组几丁质酶活性浓度为222 IU/L。 相似文献
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本研究根据截形苜蓿(Medicago truncatula)根部的几丁质酶基因保守序列(GenBank登录号:AF167328)设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法得到了紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)根部几丁质酶基因保守序列.根据得到的保守序列设计3'端和5'端特异引物,分别从3'端和5'端扩增延长该片段,最后通过序列拼接获得紫花苜蓿根部一种几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为MsChiⅣ(GenBank登录号:FJ487629).MsChiⅣ基因全长为1 025 bp,开放性阅读框全长为849 bp,编码282个氨基酸,分子量为30.5 kD,预测等电点为4.66,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区,为Ⅳ类几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,在氨基酸水平上与截形苜蓿几丁质酶蛋白同源性最高,达到98%.蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白,存在于细胞质中. 相似文献
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不同碳、氮营养对球孢白僵菌HFW-05的生长及胞外蛋白酶产量的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
在基础培养基中添加14种碳源和11种氮源测定,球孢白僵菌HFW-05菌株的萌发率、生长速率、产孢量及胞外蛋白酶活性.综合各项指标得出,HFW-05菌株生长的最适碳源为蔗糖,产孢量与产酶量最大,分别为16.13×107孢子/cm2和117.38 μg/(min·mL);最适氮源为豆粕粉,其产孢量和酶活远高于对照和无机盐类,分别为15.62×107孢子/cm2和74.01 μg/(min·mL).除硝酸钾外,无机盐类在供试浓度上均对孢子萌发和生长有抑制作用.在各种碳(氮)源培养基中添加1%蛋白胨(葡萄糖)后,菌株的产孢量和产酶量均有所提高.结果表明,HFW-05菌株的产孢量和胞外蛋白酶之间具有一定的相关性. 相似文献
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nsdA (Negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因.根据天蓝色链霉菌 A3(2)的序列设计引物扩增玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 菌株中的该基因,经测序和序列分析表明,由保守序列引物nsdA-2R和nsdA-2L克隆到的Men-myco-93-63 菌株中的该基因 800 bp片段与已知nsdA基因核苷酸保守区域序列同源性达到99%,由全长序列扩增引物nsdA WZ-R和nsdA WZ-L克隆到的该基因包含一个完整的开放阅读框,共编码 369 个氨基酸,与变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)中的nsdA 基因的核苷酸序列同源性达到100%,氨基酸序列同源性达到99%.该全长基因命名为nsdA_(mgh),其在玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中的发现为阻断该负调控基因以期获得抗生素高产工程菌株提供了重要依据. 相似文献
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为研究卵寄生真菌在寄生并破坏卵的过程中几丁质酶的作用,本研究从烟草南方根结线虫卵上分离得到虫草棒束孢HNE3,采用RT-PCR及RACE技术,首次克隆得到一个几丁质酶基因IFCHI1。该基因DNA序列全长1 417 bp,具有1个内含子,长度为61 bp,包含1个1 185 bp的开放阅读框(ORF),编码1个由394个氨基酸组成的蛋白。通过在线软件分析,该蛋白理论分子量为44.1 k Da,等电点为4.88。通过Gen Bank比对,几丁质酶IFCHI1属于第18家族糖基水解酶,比对分析不同来源真菌几丁质酶,发现该几丁质酶具有典型的催化区保守序列SIGGW和FDGIDIDWE及结合区保守序列GTWEQGVYDY和GLGGAMWWESS。同源性比对发现,该几丁质酶同昆虫寄生真菌几丁质酶同源关系近。结果表明,从虫草棒束孢HNE3克隆得到几丁质酶基因IFCHI1,为进一步明确该菌产生的几丁质酶对南方根结线虫卵壳降解及降低孵化率的作用机理提供理论依据。 相似文献
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本研究根据GenBank公布的木霉几丁质酶基因(chitinase)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从木霉(Trichoderma spp.)中克隆获得了几丁质酶基因全序列,编码区共1275bp,推测其编码424个氨基酸,该基因与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的内切几丁质酶基因chit42(GenBank accession No.L14614)具有99%的同源性。在此基础上,将获得的几丁质酶基因从pGEM-T载体中用XbaⅠ和BamHⅠ切下,克隆到pBI121植物表达载体的XbaⅠ和BamHⅠ位点,构建了植物表达载体pBI-chit并将其转入根癌农杆菌菌株EHA105。该菌株转化野生蕉(Musa itinerans Cheesm.)胚性细胞悬浮系,经过抗性筛选、胚的诱导和萌发,获得成熟体细胞胚和再生苗。通过GUS组织化学法检测和PCR方法鉴定,结果表明外源基因已经成功转入到野生蕉中。本研究为下一阶段转化香蕉栽培品种和筛选抗香蕉枯萎病新种质奠定一定的基础。 相似文献
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为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。 相似文献
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亚麻苦苷和百脉根甙等氰化物是木薯块茎、茎叶等组织或器官中的剧毒物质,细胞色素p450是调控氰化物生物合成的关键酶基因,克隆有关酶基因对于理解木薯氰化物代谢和通过转基因对木薯氰化物的改良具有重要意义。根据国际数据库中的木薯氰化物合成限速酶基因序列信息,设计特异引物,通过同源克隆法,从木薯中克隆出1626bp cDNA基因序列。序列分析表明,克隆基因共编码541个氨基酸,与数据库中的木薯CYP79D2基因在核苷酸序列、氨基酸序列同源性上均达到99％,并含有相应基因家族的保守区域,确定克隆到木薯CYP79D2全长基因。 相似文献
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为了研究绵羊细粒棘球蚴重要抗原基因Tetraspanin 1-TSP1(TSP1)和Tetraspanin 1-TSP6(TSP6)的功能,对Gen Bank中Eg基因组数据库检索,获得TSP1和TSP6的c DNA序列并设计特异性引物。以Eg头节为总RNA模板,进行RT-PCR,将PCR产物克隆到p MD19-T载体后测序并进行生物信息学分析。TSP1 c DNA全长792个核苷酸,编码263个氨基酸,该多肽含有3个潜在的N端糖基化位点,2个N端酰基化位点,与已登录的标准株TSP1基因序列(EG_11043)同源性为98.99%,其推导的氨基酸序列同源性为98.48%;TSP6 c DNA全长666个核苷酸,编码221个氨基酸,该多肽含有5个N端酰基化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,与已登录的标准株TSP6基因序列(EG_00715)同源性为98.18%,其推导的氨基酸序列同源性为85.07%。运用分子生物学软件对Eg TSP1和TSP6基因进行生物信息学分析,预测已知序列的蛋白质抗原的结构和表位,为疫苗的研发奠定了前期基础。 相似文献
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采用国际上通用的标准喷塔法测定了4株玫烟色拟青霉和4株球孢白僵菌对菊小长管蚜的毒力。结果表明,4株拟青霉在21~902个孢子/mm2的接种剂量下引起的死亡率为17.4%~100.0%,4株白僵菌在10~646个孢子/mm2的接种剂量下引起的死亡率为37.3%~100.0%。接种后第5天各菌株的致死中剂量LC50分别126个孢子/ mm2 (Pfr116),442个孢子/ mm2 (Pfr612),213个孢子/ mm2 (Pfr153),234个孢子/ mm2 (Pfr2175),155个孢子/ mm2 (Bb2880),86个孢子/ mm2 (Bb2860),99个孢子/ mm2 (Bb2861)和138个孢子/ mm2 (Bb2879)。致死中时LT50从低浓度下的较大差异向高浓度下的较小差异渐近收敛,在150个孢子/ mm2的剂量下,玫烟色拟青霉不同菌株的LT50变化范围为4.5~7.7天,球孢白僵菌不同菌株的LT50变化范围为4.5~5.1天。综合比较,4株玫烟色拟青霉中以Pfr2175的毒力最强,4株球孢白僵菌中以Bb2860最优,具有杀蚜速度快、致死浓度低等特点,具有较大的开发应用潜力。 相似文献
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对克隆获得的梨几丁质酶基因Lchi1进行生物信息学分析,从而为该基因的功能鉴定提供理论基础,以期为梨的抗病育种提供基因来源。根据Genbank中已克隆得到的几丁质酶基因保守区,在梨基因组数据库中进行Blast比对,调取DNA序列,从而设计引物,以高抗腐烂病品种‘小香水’(Pyrus ussuriensis cv. Xiaoxiangshui)为研究材料,克隆获得梨几丁质酶Lchi1基因cDNA全长,并对其进行初步的生物信息学分析。梨基因组数据库中调取的DNA序列2535 bp,含有3个外显子区、2个内含子区。Lchi1基因全长1300 bp,编码322个氨基酸,其蛋白的分子式为C1607H2407N415O468S17,分子量为35573.3 Da,理论等电点为7.10。二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构具有高度保守性。Lchi1编码蛋白为可溶性胞外蛋白,存在少量的潜在磷酸化位点,属于糖苷水解酶19家族,含有N-端信号肽,但是缺乏几丁质结合区。Lchi1基因属于CLASSⅡ几丁质酶基因,与其它科属植物的几丁质酶基因相似性均较高。 相似文献
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紫苏苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆及序列分析 总被引：3，自引：1，他引：2
苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）是迷迭香酸合成途径中苯丙氨酸支路的关键酶,它催化苯丙氨酸生成肉桂酸,完成该支路第一步反应。本实验利用同源克隆方法成功克隆了紫苏PAL基因cDNA片段,命名为PerPAL-1（GenBank登录号：HQ388347.1）,该片段长399 bp,编码133个氨基酸。通过氨基酸序列比对分析,发现其氨基酸序列与丹参和藿香PAL该片段的同源性分别高达96%和95%。PAL系统进化树表明PerPAL-1与唇形科植物的PAL亲缘关系最近。PerPAL-1基因在叶中表达最强,根中次之,而在茎中表达最弱。 相似文献
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本研究依据消减结果克隆得到山农6306编码过氧化物还原酶TaPrxQ的cDNA序列,利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析。结果表明克隆得到的TaPrxQ序列与基因组DNA对比分析得到的该基因不含有内含子,全长943bp。TaPrxQ的cDNA序列包含927bp的开放阅读框,编码308个氨基酸残基,其等电点为9.41,分子量32.4kDa。相似性比对分析显示TaPrxQ同已报道的HvPrx的氨基酸序列具相似性达到88%,从进化树分析结果推断TaPrxQ属于PrxQ类。 相似文献
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黑曲霉木聚糖酶结构基因和5'调控区基因克隆及其分析 总被引：2，自引：0，他引：2
以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5＇调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1 611 bp.通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%.在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"box的核心启动子区特征元件以及"CAAT"box,表明所克隆的调控区序列具有真核生物启动子特点,这为构建木聚糖酶高效表达载体,用于工业育种奠定了基础. 相似文献
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本研究旨在分离玉米谷氨酰胺合成酶(GS)家族重要成员Gln1-4 gDNA序列全长,分析基因结构、保守功能域与自然等位变异,为氮利用效率功能位点关联性分析奠定基础。利用PCR步移(walking)方法分离Gln1-4基因区域基因组DNA序列,用生物信息学方法分析基因结构与保守功能域,测序与序列比对法分析重要区域自然等位变异。结果表明,分离得到自交系Mo17 Gln1-4区域gDNA 3 724 bp,起始密码子至终止密码子序列长2 858 bp,登录到GenBank (登录号为EU369651), 并注释。Gln1-4基因含10个外显子与9个内含子,18个剪接位点均为保守的5'供位GU与3'受位AG模式。编码的GS蛋白由356个氨基酸组成,分子量39.2 kD,等电点(pI)为5.202。氨基末端外显子2到外显子6为氨离子结合结构保守功能域;羧基末端外显子8与外显子9构成ATP酶活性保守功能域。Gln1-4与Gln1-3基因相比,在DNA序列、氨基酸序列、基因结构、保守功能域均很保守,氨基酸序列一致性达98.31%。52个玉米自交系的Gln1-4等位变异分析中,共鉴定出318个等位变异位点,其中242个SNP,45个Indels,占90%。该基因氮利用效率功能关联性分析区间应位于氨离子结合功能域与ATPase活性保守功能域中重要的变异位点,18个剪接位点。 相似文献
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本研究以珍稀濒危植物银缕梅为材料,利用同源克隆与RACE技术克隆得到一个AP1-like基因的c DNA全长序列,命名为Psu AP1。利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸序列进行分析,结果表明,该基因序列全长916 bp,开放阅读框长度为747 bp,编码248个氨基酸,分子质量约28.62 k D,理论等电点为9.84,是一种不稳定亲水蛋白。保守结构域分析表明该基因属于MADS-box家族基因;序列比对分析显示其氨基酸序列与连香树相似性最高,达78.57%,进化树聚类分析也表明Psu AP1与连香树的氨基酸亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示该蛋白定位于细胞核。二级结构中同时含有琢-螺旋、延伸链和无规则卷曲结构,分别占比47.18%、11.29%、41.53%。荧光实时定量PCR分析表明,Psu AP1基因在花及果实中均有大量表达,推测其与花的发育以及果实的成熟相关。Psu AP1基因的克隆以及表达分析使银缕梅开花调控机理的研究取得了新的突破,为该基因功能的进一步深入研究提供了实验材料以及理论基础。 相似文献
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细胞分裂素氧化酶降解细胞分裂素,从而调控植物的生长发育,克隆和分析玉米细胞分裂素氧化酶基因(ZmCKX),为研究ZmCKX在玉米抗逆反应中的作用奠定基础。运用RT-PCR和RACE技术克隆了ZmCKX基因的cDNA全长,并对其进行了初步的生物信息学分析。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果表明,PCR扩增出一条约1035bp的片段,与目的片段大小相似。将目的片段与pMD-19t构建的pMDZmCKX重组质粒并转化为DH5α,经检测片段与原始片段大小相同。Blastn分析结果表明,其与ZmCKX1的相似性为99%。对该基因序列分析表明,ZmCKX基因编码的蛋白的开放阅读框为1035bp,起始位点为23bp,终止位点为1057bp。ZmCKX基因长1035bp,编码344个氨基酸。它与ZmCKX1基因核苷酸同源性99%。ZmCKX基因编码的蛋白是存在于细胞质中的亲水蛋白。 相似文献
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紫花苜蓿几丁质酶ClassⅢ基因克隆及生物信息学分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本文根据截叶苜蓿(Medicago truc atula)几丁质酶ClassⅢ基因(GenBank:AY294484.1)的全长序列设计引物,通过RT-PCR的方法得到紫花苜蓿(Medicago sative)几丁质酶ClassⅢ的核酸序列,命名为MsChiⅢ,在NCBI中的登录号为FJ872918。利用生物信息学软件分析MsChiⅢ,预测氨基酸序列的等电点、二级结构和三级结构,并构建系统发育树。结果显示该核酸序列全长为953bp,包括完整的开放阅读框,编码301个氨基酸,等电点为8.212。该序列所编码的蛋白属于几丁质酶18家族的内切酶,分布于细胞间隙,并含有几丁质酶18家族的特征序列——LGDVDFDIE,并预测MschiⅢ可能是一种具有几丁质酶和溶菌酶的双功能酶。 相似文献