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1.
《畜牧兽医学报》2020,(1)
旨在克隆猪NR1H3基因的可变剪接体,并预测编码蛋白的结构与功能,研究其转录本的表达特性。本试验以马身猪为研究对象,采用RT-PCR及克隆测序技术对猪NR1H3基因CDS区进行扩增和克隆,采用生物信息学方法分析NR1H3蛋白的生物学特性,采用qRT-PCR技术检测NR1H3基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、股二头肌、腰大肌和皮下脂肪组织中的表达谱及在脂肪组织中的发育性表达规律。结果表明,本研究成功克隆出猪NR1H3基因的两个转录本NR1H3-1和NR1H3-2,其中NR1H3-2为新发现的转录本(MN082630),其CDS区全长1 203bp,编码的蛋白质含400个氨基酸,属于中性不稳定蛋白;与NR1H3-1相比,NR1H3-2缺失了长度为95bp的第9外显子,编码的蛋白质NR1H3-2比NR1H3-1少了一个肝X受体的配体结合结构域;氨基酸的相似性分析发现,猪NR1H3蛋白氨基酸序列与北大西洋小须鲸、山羊、绵羊、抹香鲸、长江江豚等物种的相似性较高。NR1H3-1和NR1H3-2在所检测组织中均有表达,且在不同组织间的表达量具有显著差异(P0.05);NR1H3-1转录本在小肠中表达量最高,其次是脾、肝、股二头肌等,在心脏中表达量最低;NR1H3-2则在肝中表达量最高,其次是脾、小肠、胃和股二头肌等,在心脏中表达量最低。在各组织中(除小肠、心、肺),NR1H3-2的表达量均高于NR1H3-1,其中在肝和皮下脂肪组织中,NR1H3-2的表达量极显著高于NR1H3-1(P0.01),在胃中差异达显著水平(P0.05)。随着日龄的增加,皮下脂肪组织中NR1H3-1和NR1H3-2的表达量整体呈上升趋势,推测该基因对猪的脂肪沉积有调控作用。本试验成功克隆了猪NR1H3基因的两个可变剪接体,并推测其对猪脂质代谢及脂肪生成具有重要的生理作用。 相似文献
2.
旨在探讨NR1H3基因在猪脂肪组织中的发育性表达规律及对猪前体脂肪细胞成脂分化的影响,以确定其在脂肪沉积过程中的主要功能。本研究采用qRT-PCR方法检测30、90、240日龄马身猪皮下脂肪组织中NR1H3的发育性表达规律;采集5日龄杜长大仔猪背部脂肪组织,分离猪前体脂肪细胞;通过细胞免疫荧光技术检测细胞中Adiponectin含量以鉴定细胞的纯度;构建猪NR1H3基因的过表达载体,设计NR1H3 siRNA序列,分别转染分离得到的猪前体脂肪细胞,采用qRT-PCR、Western blot和油红O染色等方法检测过表达和干扰效率及它们对成脂分化关键基因表达的影响。结果表明,马身猪皮下脂肪组织中NR1H3的表达量随日龄增加呈上升趋势,30日龄时表达量最低,240日龄时表达量最高,差异极显著(P<0.01)。与对照组相比,猪前体脂肪细胞中过表达NR1H3,脂肪细胞的脂滴数明显增多,下游靶标SREBP-1c和ChREBP的表达量极显著提高(P<0.01),且成脂关键基因FAS、C/EBPβ、PPARγ和FABP4的mRNA表达量极显著提高(P<0.01),促进成脂过程;相反,干扰NR1H3基因,脂滴数明显减少,下游靶标及成脂关键基因的mRNA表达量极显著下调(P<0.01),抑制成脂过程。本研究表明,NR1H3基因是猪前体脂肪细胞成脂分化的正调节剂,通过影响其下游靶标SREBP-1c和ChREBP的表达而影响成脂分化,研究结果对阐明猪脂肪沉积的分子机理、改善肉质品质有重要意义。 相似文献
3.
旨在克隆山羊NR4A1基因的CDS区序列,明确其组织和细胞表达模式,以及探究过表达NR4A1基因对山羊皮下脂肪细胞分化的影响。本试验利用双酶切法构建山羊过表达载体pcDNA3.1-NR4A1。以1周岁简州大耳羊（n=5）为试验动物。利用RT-PCR方法和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术克隆NR4A1基因编码区序列并明确其时空表达特性,再将山羊pcDNA3.1-NR4A1载体转染皮下脂肪细胞使NR4A1过表达,利用形态学方法检测过表达后脂滴聚集的变化,同时采用qPCR方法检测脂肪分化标志基因相对表达水平的变化。结果获得山羊NR4A1基因的编码区序列是1 797 bp,编码598个氨基酸;NR4A1在山羊各组织中广泛表达,且在山羊背最长肌中的相对表达水平最高（P<0.01）,在山羊皮下脂肪细胞分化60 h表达量最高（P<0.01）;过表达NR4A1基因显著促进山羊皮下脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、LPL、SREBP1和AP2的相对表达水平（P<0.05）。NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子,且可能是协同脂肪分化标志基因的表达量来实现的。 相似文献
4.
本研究旨在克隆猪CPB2基因的不同可变剪接体，预测对应蛋白的功能特性以及研究不同转录本表达特性。以健康状态和体重相同的3头12月龄巴马小型猪为试验动物，通过RT-PCR技术及基因平末端克隆技术扩增猪CPB2基因的CDS区及部分非编码区，利用生物信息学工具预测CPB2编码蛋白的基本生物学特征，利用RT-PCR技术检测CPB2基因在肝、心、肾、皮下脂肪、肠系膜脂肪、股二头肌和背最长肌中的表达特征。以实验室制备的代谢性疾病易感猪为试验动物，利用qRT-PCR技术检测CPB2基因在富营养饮食效应下肝中的表达特征。结果表明，本研究成功克隆出猪CPB2基因的3种可变剪接体（CPB2-1、CPB2-2和CPB2-3），其中CPB2-1与NCBI序列XM_001929146.4相同，CPB2-2和CPB2-3为新发现转录本。与CPB2-1相比，CPB2-2和CPB2-3发生了5'端可变剪接（alternative 5'splice site，A5SS）事件；CPB2-1编码423个氨基酸的酸性不稳定性蛋白，CPB2-2和CPB2-3编码同种281个氨基酸的碱性不稳定性蛋白；与CPB2-1相比，CPB2-2和CPB2-3缺少信号肽和激活肽，但具有相同羧肽酶活性结构域；CPB2基因3种转录本仅在肝和肾中表达，其他组织无表达；在富营养饮食诱导的代谢性疾病易感猪的肝中，CPB2-1（P<0.01）和CPB2-2（P<0.01）显著降低，CPB2-3未显著降低（P=0.14）。综上，本研究成功在肝中克隆了猪CPB2的3种可变剪接体，推测CPB2-1是行使纤溶与凝血等生理功能的正常转录本；新发现转录本CPB2-2和CPB2-3被留在肝和肾中可能具有羧肽酶活性和重要生理学功能；CPB2基因可能与代谢相关的慢性肝病存在一定联系。 相似文献
5.
【目的】 通过分析马身猪和大白猪背最长肌转录组测序数据,筛选肌内脂肪沉积相关基因,并对其表达特性进行分析。【方法】 采集180日龄马身猪和大白猪背最长肌,采用RNA-Seq技术对其进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行GO功能和KEGG通路富集分析;采用GeneCards在线查询基因功能,进一步筛选与肌内脂肪沉积相关的差异基因;采用实时荧光定量PCR技术检测差异基因在2个品种猪不同组织以及肌内脂肪细胞成脂分化过程中的表达变化。【结果】 获得2个品种猪背最长肌差异表达基因共280个,其中128个表达显著上调,152个表达显著下调。GO功能富集分析注释到46个条目,其中生物过程24条,分子功能8条,细胞组分14条。KEGG通路分析显著富集到PPAR信号通路、MAPK信号通路和脂肪细胞因子信号等脂肪沉积相关通路。GeneCards功能查询获得TRAF2、DUSP1、ACOT4、NR4A1、SLC27A6、PLIN5共6个与脂肪沉积相关的基因。实时荧光定量PCR分析表明,马身猪和大白猪背最长肌中NR4A1、DUSP1、PLIN5基因表达量差异显著或极显著(P<0.05;P<0.01),TRAF2、ACOT4和SLC27A6基因表达量差异不显著(P>0.05),但表达变化趋势与测序结果一致;马身猪腹部皮下脂肪组织中NR4A1和PLIN5基因表达量极显著高于背部皮下脂肪组织(P<0.01),而大白猪背部皮下脂肪组织中NR4A1和DUSP1基因表达量极显著高于腹部皮下脂肪组织(P<0.01),PLIN5基因表达量显著高于腹部皮下脂肪组织(P<0.05)。在背部皮下脂肪组织中,NR4A1、DUSP1和PLIN5基因在大白猪中的表达量极显著高于马身猪(P<0.01);在腹部皮下脂肪组织中,NR4A1和DUSP1基因在大白猪中的表达量显著高于马身猪(P<0.05),PLIN5基因表达量在2个品种间无显著差异(P>0.05)。体外培养的猪肌内脂肪细胞分析表明,随着成脂天数的增加,NR4A1基因表达量呈下降趋势,DUSP1和PLIN5基因表达量均呈上升趋势。【结论】 本研究获得了NR4A1、DUSP1、PLIN5 3个与猪肌内脂肪沉积相关的候选基因,可为后续进一步探讨猪肌内脂肪沉积调控机制提供一定的参考。 相似文献
6.
旨在研究猪C1QTNF3基因可变剪接体的特性及miR-101通过C1QTNF3基因促进猪脂肪SV细胞成脂分化的机制。本研究采集3头30日龄健康马身猪仔公猪心、肝、脾、肺、肾、胃、股二头肌、腰大肌、皮下脂肪和背部脂肪组织样品,首先利用RT-PCR技术和生物信息学方法对C1QTNF3基因的不同转录本进行扩增和生物学特性分析,采用qRT-PCR技术检测C1QTNF3基因不同转录本在猪组织中的表达变化。随后,利用生物信息学预测发现,C1QTNF3上游的调控因子是miR-101,采用双荧光素酶报告试验验证miR-101对C1QTNF3的调控作用。最后,利用油红O染色和qRT-PCR技术检测过表达miR-101对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响。基因克隆得到猪C1QTNF3存在两个转录本C1QTNF3和C1QTNF3-1,其中C1QTNF3-1为新鉴定的转录本;测序分析显示,与C1QTNF3相比,C1QTNF3-1的第1外显子区域缺失了219个碱基,少编码73个氨基酸。进化树分析显示,猪C1QTNF3和C1QTNF3-1蛋白序列与人和马来亚穿山甲等物种的亲缘关系较近。C1QTNF3和C1QTNF3-1在猪各组织中均有表达,且在各组织中C1QTNF3-1的表达量均极显著高于C1QTNF3（P<0.01）。过表达miR-101极显著下调C1QTNF3 3'UTR区域的荧光素酶活性（P<0.01）和C1QTNF3 mRNA的表达（P<0.01）,同时增加了脂肪细胞成脂分化关键基因PPARγ、C/EBPβ、SREBP-1c和FABP4的mRNA表达量（P<0.01）。本试验成功克隆了猪C1QTNF3基因的两个可变剪接体,其中C1QTNF3-1在猪不同组织中均高表达,推测该转录本为基因发挥功能的主要亚型。并深入研究了C1QTNF3基因的上游调控因子,揭示了miR-101靶向C1QTNF3促进成脂分化的机制,丰富了C1QTNF3的生物学作用和调控网络。 相似文献
8.
旨在获得猪CCAR1基因的完整CDS序列，研究其亚细胞定位和表达特性，探究其对细胞增殖的影响和作用机制。本研究以1日龄马身猪肾组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术分段扩增猪CCAR1基因的CDS区，通过测序和序列拼接获得完整CDS区；采用细胞免疫荧光技术检测CCAR1在PK15细胞中的定位；采用qRT-PCR技术检测猪CCAR1基因的时空表达规律；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PK15细胞的CCAR1基因，通过qRT-PCR、Western blot以及CCK8（cell counting kit 8）技术检测CCAR1基因敲除对细胞增殖能力及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。结果表明，猪CCAR1基因的完整CDS区长3 459 bp（MH301308.1），在PK15细胞的细胞质和细胞核中均有表达。大白猪和马身猪不同组织CCAR1的表达谱基本相似，在所检测的组织中均有表达，均表现为在肾和小肠中表达量最高，在脾、肝、小脑和肌肉中呈中度表达，在心和皮下脂肪中低表达；CCAR1基因在大白猪和马身猪初生、3月龄和6月龄3个年龄阶段的两种骨骼肌中也均有表达。CRISPR/Cas9基因编辑系统能有效降低CCAR1的表达，在转染48 h后，相比于对照组，试验组都对细胞增殖产生极显著抑制（P<0.01）；CCAR1基因敲除后，细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降（P<0.05），Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降（P<0.05），Wnt通路核心蛋白β-catenin和凋亡标记基因Caspase3的表达量无显著差异。CCAR1基因在猪不同组织和不同发育阶段均有表达，可能通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的表达而影响细胞增殖，在猪的生长发育过程中起重要作用。 相似文献
9.
旨在探究牛IRX3基因组织表达规律，并鉴定其启动子区关键转录因子，以期阐明其转录调控机制。本研究采集3头成年公牛心、肝、脾、肺、肾、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、网胃、瘤胃、皱胃及睾丸组织，利用荧光定量PCR检测IRX3基因在不同组织中相对表达量。同时克隆牛IRX3基因1.8 kb启动子区序列并构建其启动子6个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体，分别转染3T3-L1和C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子，借助定点突变及siRNA干扰技术在3T3-L1细胞系内初步鉴定关键转录因子对IRX3基因的转录调控作用。结果表明，IRX3基因在牛13个不同组织中均有表达，且在肺、肾、心、皮下脂肪、背最长肌中高表达（P<0.05）。利用双荧光素酶报告载体检测到牛IRX3基因核心区域在-372/-42 bp。结合定点突变及siRNA干扰技术初步鉴定NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1转录因子对IRX3基因的转录活性有重要的调控作用。综上表明，牛IRX3基因在背最长肌和脂肪组织中表达量相对较高，其启动子1.8 kb区有8个CpG岛，核心区关键转录因子NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1位于CpG岛内且调控IRX3基因转录活性。本研究结果为探究IRX3基因在牛脂肪沉积过程中的分子调控机制奠定了重要理论基础。 相似文献
10.
试验旨在克隆山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1 cDNA序列,探究其表达的组织特异性及其在小肠中的表达发育模式。参考GenBank已发表的绵羊、牛SLC3A1基因mRNA序列设计引物,克隆山羊SLC3A1基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR的方法分析其在1日龄山羊11种组织及其在1日龄、6月龄、8月龄、10月龄、12月龄山羊十二指肠、空肠、回肠中的mRNA表达情况。结果表明,成功克隆得到了山羊SLC3A1基因cDNA序列,其与绵羊、牛、野猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为99%、97%、88%、86%、80%和79%。SLC3A1基因转录表达有明显的组织特异性,其在1日龄山羊肾脏、回肠、空肠、结肠中表达量依次降低(P<0.05),其他组织中表达量很低。同一月龄山羊,SLC3A1基因在不同肠段的表达量数值上回肠>空肠>十二指肠。SLC3A1基因在不同月龄山羊十二指肠表达量以1日龄山羊为最高(P<0.05),6~12月龄山羊相同肠段之间表达量无显著差异(P>0.05);空肠表达量随山羊年龄的增加均呈现逐步降低的趋势;回肠表达量在各个月龄山羊之间差异不显著(P>0.05)。结果说明,山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1的主要表达部位在肾脏和肠道,推测b0,+碱性氨基酸转运系统转运氨基酸的主要部位为肾脏和肠道。SLC3A1基因在山羊小肠受肠段和发育阶段的影响,具有不同的表达发育模式。 相似文献
11.
本研究旨在分析环腺苷酸应答元件结合蛋白H（cyclic AMP-responsive element-binding protein 3-like 3，CREB-H）在猪不同组织中的表达谱及其在马身猪和大白猪肝脏中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测1日龄猪12个组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、小脑、下丘脑、背最长肌、股肌和腰肌）中CREB-H基因的表达谱，以及CREB-H在1、30、60、90、120、150和180日龄马身猪和大白猪肝脏中的表达规律。结果显示，CREB-H基因mRNA在马身猪的12个组织中广泛表达，其中在肝脏和小肠中高表达；CREB-H蛋白在肝脏组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05），在心脏、脾脏和小脑中不表达。猪肝脏CREB-H基因mRNA和蛋白的发育表达受日龄、品种、品种与日龄相互作用的影响（P<0.01）。马身猪和大白猪肝脏中CREB-H基因mRNA和蛋白的表达量均在1日龄时达到最大值。在各发育阶段，马身猪CREB-H蛋白的表达量均极显著高于大白猪（P<0.01），且CREB-H主要在猪肝脏中表达。CREB-H在两猪种肝脏中的表达存在时空差异，可能与猪在不同发育期的脂质代谢能力有关，本试验结果为研究猪的脂质代谢调控机制提供一定的理论依据。 相似文献
12.
ZHANG Ningfang WU Yiqi CHENG Zhimin YANG Xiaowei LI Meng YANG Yang LIU Hong GAO Pengfei CAI Chunbo GUO Xiaohong LI Bugao CAO Guoqing 《畜牧兽医学报》1956,51(11):2651-2664
The aim of this study was to obtain the complete coding sequence (CDS) of CCAR1 gene, and to explore its subcellular localization, expression profile and its effects on cell prolification and action mechanism in pig. In this study, the cDNA from kidney tissue of 1-day-old Mashen pigs were used as the template to obtain the full-length CDS of CCAR1 gene by RT-PCR and sequencing. The cellular immunofluorescence staining was used to explore the subcellular localization of CCAR1 in PK15 cells. The temporal and spatial expression profile of CCAR1 was investigated by qRT-PCR in this study. The CCAR1 gene in PK15 cells was knocked out by using CRISPR/Cas9 gene editing technology, and the effects of CCAR1 gene on cell proliferation and expression of cell proliferation and apoptosis related genes were investigated by qRT-PCR, Western blot and CCK8 (cell counting kit 8) technologies in this experiment. The results showed that the complete CDS region of pig CCAR1 gene was 3 459 bp in length (MH301308.1). CCAR1 protein was localized in both cytoplasm and nucleus of PK15 cells. The expression profiles of CCAR1 mRNA between Large White and Mashen pigs was similar, which was expressed in all detected tissues, with the highest expression in kidney and small intestine, middle expression in spleen, liver, cerebellum and muscle, and the lowest expression in heart and subcutaneous fat. Temporal expression results showed that CCAR1 was expressed in both psoas muscle and longissimus dorsi muscle at 3 developmental stages both in Mashen and Large White pigs. The CRISPR/Cas9 gene editing system effectively reduced the expression of CCAR1. CCK8 results showed that after 48 hours of transfection, compared with the control group, the proliferation of cells in the experimental groups were extremely significantly inhibited (P<0.01). After CCAR1 gene knocked out, the expression level of Mki67, a marker of cell proliferation, was significantly decreased (P<0.05). There was no significant difference in the expression level of Caspase3 and the core protein β-catenin in Wnt pathway between control group and experimental groups, and the expression level of downstream target gene C-myc of Wnt pathway was decreased significantly(P<0.05). CCAR1 gene was expressed almost in all tissues at different developmental stages, and affected cell proliferation by regulating the expression levels of Mki67 and C-myc, and played an important role in growth and development of pig. 相似文献
13.
试验旨在探究松辽黑猪NR5A2基因多态性及其与繁殖性状的关联性。选取130头松辽黑猪作为研究对象,利用PCR直接测序法查找NR5A2基因6个外显子的SNP位点,通过HRM分型技术分析SNP位点的多态性,使用SPSS 19.0软件分析NR5A2基因SNP位点多态性与母猪总产仔数、产活仔数、仔猪初生重、3周龄重、断奶重及断奶仔猪数、乳头数的关联性。结果显示,松辽黑猪NR5A2基因第6外显子上存在1个SNP位点（C99T）,检测到3种基因型：CC、CT和TT。群体遗传参数分析及卡方适合性检验结果显示,该SNP位点在松辽黑猪群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）,但C/T突变位点杂合度相对较低,在松辽黑猪群体中的变异较小,属于中度多态（0.25<PIC<0.5）。关联性分析结果表明,在NR5A2基因C99T位点上,CC基因型个体的总产仔数、产活仔数及断奶仔猪数均最高,且显著高于TT基因型（P<0.05）,产活仔数及断奶仔猪数均显著高于CT基因型（P<0.05）;各基因型仔猪初生重、3周龄重、断奶重及乳头数均无显著差异（P>0.05）。综上所述,NR5A2基因第6外显子存在突变位点C99T,与松辽黑猪产仔数存在显著关联性,但该突变位点能否作为松辽黑猪产仔数的遗传标记,需要对更大的群体进行进一步研究。 相似文献
14.
LIU Cui-cui GUO Xiao-hong CAO Guo-qing GAO Peng-fei PU Zhong-de NIU Jiao-yan ZHANG Qi LI Meng JIN Yu-shu LI Bu-gao 《中国畜牧兽医》2015,42(10):2726-2731
The aim of this study was to investigate the developmental patterns of ApoCⅡ gene mRNA in liver in Mashen and Large White pigs, and study the relationship between the expression level of ApoCⅡ and the lipid metabolism in pigs.The mRNA relative expressions of ApoCⅡ gene in liver at seven stages of 1,30,60,90,120,150,and 180-day old in Mashen and Large White pigs were determined by quantitative Real-time PCR.The results showed that the developmental trend of ApoCⅡ mRNA expression in liver between Mashen and Large White pigs was different.The ApoCⅡ mRNA abundance was decreased from birth to 60-day old,then increased at 90-day old,and decreased again after that in Mashen pig.However,the relative expression amount in Large White pig was gradually decreased from birth to 150-day old and increased again at 180-day old.Except for the ApoCⅡ mRNA expression amount at 1-day old,the differences of the expression amount at other stages in Mashen and Large White pigs were significant or extremely significant (P<0.05 or P<0.01).The ApoCⅡ mRNA expression in liver was affected by age and breed,and could play an important role in lipid metabolism in pigs. 相似文献