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[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。 相似文献
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【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗,不仅可以大幅度提高单位产量,实现高密度细胞和高病毒产率,同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L,高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原,开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在MDCK细胞及悬浮MDCK细胞上增殖。在MDCK细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验,确定了H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上最佳收获时间为64 h,最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10~(-4),最佳TPCK-胰酶浓度为2μg·mL~(-1),根据确定的最佳培养条件连续传代,并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在MDCK细胞上传至第5代时,HA可达1﹕256,每1 mL病毒含量达到10~(8.5)TCID50,每0.1 mL病毒含量达到10~(8.5)EID50,均高于其他代次。【结论】将第5代确定为MDCK细胞传代最佳代次,可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮MDCK细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验,确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮MDCK细胞上最佳收获时间为48 h,最佳接毒剂量MOI为10~(-2),最佳TPCK-胰酶浓度为4—8μg·mL~(-1)。在实际疫苗生产过程中,可选择MDCK细胞或悬浮MDCK细胞来扩繁种毒。 相似文献
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[目的]比较3种培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果。[方法]采用DMEM+10%血清、低血清培养基(MEM-MD-611)、无血清培养基(SFE4Mega)3种培养基制备MDCK细胞单层,分别接种不同稀释度的H9亚型禽流感病毒。然后,分别加入含10μg/ml胰蛋白酶的3种培养基作为维持液,培养病毒,每隔24 h观察其细胞病变,并测定上清HA滴度。[结果]在培养72～96 h时,无血清培养基病毒液的HA滴度高于低血清培养基,而低血清培养基则高于含血清培养基。[结论]3种培养基均可用于制备禽流感病毒抗原,其中无血清培养基、低血清培养基更适用于流感病毒抗原的制备。 相似文献
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[目的]制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持.[方法]以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞.[结果]经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为27~210,腹水HI效价为216~219;单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类,其轻链均为K链.3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应.3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好.[结论]用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性. 相似文献
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H9N2亚型禽流感病毒(AIV)变异快、传染性强,由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果,导致H9N2亚型禽流感时有发生。为研发具有广谱保护性的H9亚型禽流感疫苗,本研究利用生物信息技术,对H9亚型AIV HA基因序列进行分析,设计获得HA基因序列。将HA基因构建于杆状病毒表达系统,表达的重组HA蛋白血凝效价为1×212,与不同分支H9亚型AIV阳性血清具有良好的交叉反应活性。将重组蛋白制备成疫苗(rHA疫苗)免疫10日龄雏鸡,免疫后28 d将不同亚分支的H9亚型AIV流行毒株115和YZ株分别以1×106EID50(半数鸡胚感染量)感染试验鸡,rHA疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组。本研究结果表明H9亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景,可以用于防控H9 AIV感染。 相似文献
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鹅源H5N1亚型禽流感病毒对SPF雏鸡血液免疫功能的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
以21日龄SPF雏鸡为实验动物,应用细胞培养和免疫酶技术,通过外周血液免疫球蛋白(Igs)含量、T和B淋巴细胞数量及其增殖功能的检测,较全面系统的研究了鹅源H5N1亚型中强毒禽流感病毒(AIV)感染SPF雏鸡后,其外周血液上述被检指标的动态变化.结果表明,鹅源H5N1亚型中强毒AIV感染SPF雏鸡后,其血清IgG和Ig... 相似文献
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为构建表达禽流感病毒 ( AIV)血凝素 ( HA)基因的重组禽痘病毒 ,将禽痘病毒启动子LP2 EP2驱动的 H7亚型 AIV HA基因 c DNA和大肠杆菌 Lac Z基因插入禽痘病毒疫苗株 F- 0 1 7的复制非必需区。经蓝斑筛选后 ,对重组病毒又进行了 3次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板 ,利用 H7亚型 AIV HA基因特异的引物进行聚合酶链式反应 ,均扩增出 1条特异的1 .7kb DNA条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验 ,均检测到 HA蛋白 ,表明 H7AIV HA在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为 AIV病毒活载体疫苗的研制奠定了基础 相似文献
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《江苏农业科学》2016,(6)
H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)是危害我国养禽业的主要病毒之一,造成了严重的经济损失。根据H9亚型AIV的HA基因设计了1对引物,建立了H9亚型禽流感病毒的RT-PCR鉴定方法。H9亚型AIV的HA基因预期扩增的目的片断长度为425 bp。对H9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10~(4.25)EID_(50)/100μL。建立的RT-PCR检测方法对H9、H3、H4、H5亚型AIV及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等进行检测,结果仅有H9N2亚型AIV出现特异性目的条带,其他均未出现目的条带,与其他常见禽病病原无交叉反应;用建立的RT-PCR和病毒分离2种方法同时对10株H9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品进行检测,结果 2种检测方法的符合率达100%。说明该鉴定方法特异性强,敏感性较高。 相似文献
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分别应用病毒分离和鉴定试验以及禽流感病毒(AIV)型特异性RT-PCR技术,对疑似H9亚型AIV感染的10份病死鸡组织病料进行了实验室诊断。结果有7份病例用上述两种方法检测均为阳性;2份病料仅分离到H9亚型AIV;1份病例仅H9亚型RT-PCR阳性。研究表明,对于H9亚型AIV临床组织样品的检测,病毒分离试验的敏感度高于RT-PCR。当检测因运输或消毒药物作用而导致病料中病毒死亡的H9亚型AI临床病例时,RT-PCR有明显的优势。将RT-PCR和病毒分离鉴定两种方法相结合,可提高临床样本的H9亚型AIV的检出率。 相似文献
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为了分离舍饲羊群羊痘病毒并对其进行诊断研究,对山西舍饲羊群疑似羊痘发病羊的口唇痘状痴皮组织提取物进行细胞培养以扩增病毒,对病变细胞用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察,然后进行动物回归实验和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).结果表明:扩增的病毒经连续培养3代后出现规律性细胞病变;用常规HE染色可见细胞中出现由于病毒感染产生的包涵体;动物回归实验表明已分离的病毒可导致动物发生痘性病变:用ELISA 检测出现显色反应,表明样品中存在与酶标抗体发生反应的病毒抗原,样品病毒浓度为6.835 IU·L-1.实验成功诊断并分离出山西舍饲羊群羊痘,为后续研究提供了理论基础. 相似文献
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Exposure of human Wi-38 cells to human serums containing Australia antigen, and presumably serum hepatitis virus, renders the cells refractory to infection by Newcastle disease virus as detected by the hemadsorption-negative plaque test for intrinsic interference. Induction of the Newcastle disease virus refractory state could be passed in cell culture with up to a 1 : 100,000 dilution of material obtained from cells "infected" with serums containing Australia antigen after filtration (0.45-microm pores) and heating to 60 degrees C for 1 hour. Human antiserums to the Australia antigen prevented induction of the Newcastle disease virus refractory state. 相似文献
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鸡新城疫病毒感染不同细胞的病变特性研究 总被引：2，自引：1，他引：1
为了探讨鸡新城疫病毒(Newscastle disease virus,NDV)感染不同细胞的病变特性,选用NDV强、弱毒株感染鸡胚成纤维细胞(DF-1)、仓鼠肾细胞(BHK-21)和人宫颈癌细胞(HeLa).结果表明:NDV强毒株在DF-1、BHK-21、HeLa上均能增殖,在DF-1、BHK-21、HeLa上产生的细胞病变(cytopathic effect,CPE)以发生细胞融合和形成合胞体为主要特征,在DF-1上增殖速度较快,HA效价也高;NDV弱毒株含10μg/mL胰蛋白酶的DMEM培养基上,DF-1、BHK-21、HeLa可引起细胞变圆、脱落,没有典型的CPE,盲传15代CPE特征未发生改变,血球凝集(HA)效价较低.可见,NDV在其种属来源相同的DF-1中更适宜增殖,DF-1可用作NDV感染的最佳细胞模型. 相似文献
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Infection of normal human epithelial cells by Epstein-Barr virus 总被引：5，自引：0，他引：5
Primary cultures of epithelial cells were grown from the tonsils and adenoids of patients with diseases not related to Epstein-Barr virus. The cells could not be infected by Epstein-Barr virus. Fluorescein-labeled Epstein-Barr virus and a cytofluorograph were then used to show that the epithelial cells do not have detectable receptors for the virus. However, implantation with Epstein-Barr virus receptors gave the cells the ability to bind the labeled virus. One to 5 percent of receptor-implanted cells exposed to the transforming B95-8 substrain of the virus expressed Epstein-Barr nuclear antigen. The early and viral capsid Epstein-Barr virus-determined antigens were not detected in the virus-infected cultures. The results show that normal human epithelial cells from the nasopharynx become susceptible to infection by Epstein-Barr virus when the membrane barrier resulting from the lack of viral receptors is overcome by receptor implantation. 相似文献
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以患病牙鲆的囊肿组织为试验材料,冰浴匀浆后采用低速离心的方法提取淋巴囊肿病毒,用粗提的病毒液感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,同时应用以抗淋巴囊肿病毒单克隆抗体为第一抗体的间接免疫荧光抗体技术检测淋巴囊肿病毒是否感染了牙鲆鳃细胞并在其中增殖.结果发现生长旺盛的单层牙鲆鳃细胞接种淋巴囊肿病毒2天后出现明显的细胞病变效应,形成空斑,应用间接免疫荧光抗体方法检测结果为抗淋巴囊肿病毒单抗与未接种淋巴囊肿病毒的牙鲆鳃细胞呈阴性反应,而接种病毒的牙鲆鳃细胞,细胞质中有明显的特异性荧光,该结果说明牙鲆鳃细胞系是淋巴囊肿病毒的敏感细胞系. 相似文献
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【目的】明确麻雀源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对鸡群的致病性,既有利于了解麻雀在H9N2亚型AIV传播生态链中的作用,对科学防控H9N2亚型AIV的暴发流行也具有重要意义。【方法】选取3株HA基因处于不同进化分支的广西麻雀源H9N2亚型AIV进行SPF鸡致病性试验,将84羽4周龄SPF鸡随机均分为4组(空白对照组和3个感染组)。感染组每组以100μL稀释至106EID50/100μL的病毒液经鼻腔感染16羽SPF鸡,于病毒感染24 h后分别在各感染组放入剩余的5羽SPF鸡作为空白接触组,感染后观察鸡群的临床症状及剖检病理变化,在不同时间点采集器官组织制作病理切片并检测不同器官中的病毒滴度及分布情况。【结果】3株麻雀源H9N2亚型AIV在HA蛋白裂解位点处不存在多个碱性氨基酸插入现象,表现为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV(LPAIV)的典型分子特征;对鸡胚的半数感染量(EID50)在10-6.0/0.2 mL~10-6.8/0.2 mL,半数致死量(ELD50)在10-6.8/0.2 mL~10-7.2/0.2 mL。3株H9N2亚型AIV均可直接感染SPF鸡,且病毒在不同器官中的滴度及分布存在一定差异;感染SPF鸡后均未表现出明显的临床症状和死亡现象,但在上呼吸道的气管及肺脏出现一定程度的充血和出血、气管纤毛脱落及炎性淋巴细胞浸润等病变。3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的排毒期主要介于第1~7 d,且能不经体内适应而直接感染鸡群并排毒;3株麻雀源H9N2亚型AIV在SPF鸡各器官中的复制能力存在一定差异,可在气管和肺脏中进行有效复制,而在肝脏、脑、胰腺、胸腺、心脏、盲肠扁桃体及法氏囊中均未检测到对应的病毒。【结论】麻雀源H9N2亚型AIV可直接感染鸡群且具有在鸡群间水平传播的潜在风险,提示在家禽饲养、运输及销售等环节要做好相关的防护措施,切断AIV在野鸟与家禽间的传播途径,减少禽流感暴发造成的经济损失。 相似文献
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The pathway of infection of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus in an insect host 总被引：18，自引：0，他引：18
An immunohistochemical study was conducted to detect the temporal infection sequence of Autographa californica M nuclear polyhedrosis virus in Trichoplusia ni larvae. Staining patterns indicated that the initial infection occurred in the midgut, simultaneously in columnar epithelial and regenerative cells, but that subsequently this tissue recovered. A major envelope glycoprotein stained in a polar fashion when it was expressed in columnar epithelial cells, but not when expressed in other cells types. Systemic infection was mediated by free virus for some tissues whereas infected hemocytes appeared to spread virus to other tissues by an unknown mechanism. A cell to cell spread within several tissues was detected. These results have important implications for baculoviruses engineered for improving their pesticide potential. 相似文献