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1.
超表达草生欧文氏菌crtB基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
利用重组PCR 技术,将草生欧文细菌八氢番茄红素合成酶基因crtB 与豌豆质体定位序列ts-rbcS 融合,插入质粒载体PMV 中,构建了植物表达载体pBI-ts-rbcS-crtB,并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄。PCR 检测、Southern 杂交和RT-PCR 分析表明,外源基因crtB 已整合到番茄基因组中,并在转基因植株中得到表达。转基因番茄果实中的类胡萝卜素总量增加1.3 ~ 2.5 倍,八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素分别增加了4.3、1.8、2.2 和2.3 倍。转化株系中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。crtB 基因过量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。 相似文献
2.
以栽培番茄品种（系）Ailsa Craig(AC)、B5和B9为试材，利用CRISPR/Cas9双元表达载体系统，对番茄品质调控关键基因SlGLK2和SlMYB12进行定点敲除。获得AC背景下SlGLK2和SlMYB12的基因编辑植株各9株，B5背景下SlGLK2的基因编辑植株3株，B9背景下SlMYB12的基因编辑植株4株。通过对靶点测序发现，在靶位点的PAM上游3～4 bp处发生了不同形式的碱基缺失、插入或替换，主要以1～10 bp的缺失和单碱基G和T的插入为主；也产生了两靶点间的大片段缺失，最大片段为334 bp。AC背景下敲除SlMYB12产生粉色果实，敲除SlGLK2基因，果实肩部的绿色明显变浅，B5背景下的3株基因编辑番茄均无“绿肩”。本研究中利用CRISPR/Cas9技术在不同番茄种质中成功创制了敲除SlGLK2或SlMYB12的基因编辑材料，以期为番茄品质育种提供优良种质。 相似文献
3.
为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。 相似文献
4.
利用RACE技术和RT-PCR相结合,从欧李[Cerasus humilis(Bge)Sok]果实中克隆获得长度为1798 bp的番茄红素β–环化酶(lycopeneβ-cyclase)基因ChLCYb的cDNA全长序列,开放读码框为1515 bp,编码503个氨基酸。序列分析发现,ChLCYb具有植物LCYb保守区(Plant LCYb conserved region)、FAD/NAD(P)结合区(Dinucleotide-binding signature)、"Cyclase motif 1"、"Cyclase motif 2"和"lycopeneβ-cyclase motif"等典型结构特征,在N–端存在1~84个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在85~106、209~227、373~391和460~480氨基酸区域包含4个跨膜结构域。荧光定量PCR结果表明,ChLCYb在叶中表达量最高,其次是幼果,在根中最低;在欧李果实发育过程中,果皮中ChLCYb表达量高于果肉,果皮中ChLCYb表达量先升高,在花后90 d左右表达量最高,然后呈缓慢下降趋势,而果肉中ChLCYb表达量相对平稳。ChLCYb表达模式与果皮和果肉中β–胡萝卜素含量的积累呈显著正相关(r=0.824和r=0.712,P0.05)。利用大肠杆菌工程菌体系诱导表达了ChLCYb蛋白,并证实其可催化工程菌株中番茄红素向β–胡萝卜素转化,其转化效率达71.22%。在番茄中超量表达ChLCYb促进果实中番茄红素向β–胡萝卜素的转化和积累,转基因株系L-11号果实中的β–胡萝卜素含量高达692.18μg·g~(-1) DW,是非转基因对照的4.42倍。 相似文献
5.
选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。 相似文献
6.
以‘轮台小白杏’果实为材料,利用转录组测序筛选获得的类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD1基因片段设计特异引物,使用 RACE技术克隆全长cDNA序列,命名为PaCCD1。该基因长为1 885 bp,开放阅读框（ORF）1 644 bp,编码547个氨基酸残基,蛋白质分子量为61.699 kD。氨基酸序列比对发现,PaCCD1与甜瓜等其他已知功能的CCD1相似,具有4个保守的组氨酸残基、2个半保守的谷氨酸残基和1个天冬氨酸残基。活性位点分析表明,PaCCD1编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点。进化树分析表明,PaCCD1与AtCCD1（拟南芥）及碧桃等的CCD1在同一分支上,其中与PpCCD1（碧桃）和CmCCD1（甜瓜）的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,PaCCD1在杏幼果中表达量最高,在花中表达量次之,而在根、叶和1年生枝条中不表达,具有组织表达特异性。杏果实发育和成熟过程中,果皮和果肉中PaCCD1的表达均显著上调,主要类胡萝卜素β–胡萝卜素和叶黄素的含量显著下降,而脱辅基类胡萝卜素类香气物质二氢–β–紫罗兰酮、β–紫罗兰酮和β–大马酮的含量显著增加。将目的基因通过转化大肠杆菌,获得了体外表达蛋白,饲喂类胡萝卜素的底物特异性测定发现,PaCCD1蛋白能较快吸收β–胡萝卜素产生二氢–β–紫罗兰酮和β–紫罗兰酮,能吸收叶黄质产生β–大马酮。据此推测PaCCD1是控制杏果实脱辅基类胡萝卜素类香气物质形成的关键基因。 相似文献
7.
将从欧李果实中分离的ChPSY cDNA经过序列分析、酶切之后,连接到植物表达载体PMV,构建了植物重组载体pBI-ChPSY,并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄,获得了12株抗性植株。PCR检测和Southern杂交结果显示,12株抗性植株均为阳性,说明外源基因ChPSY整合到转化植株的基因组中。RT-PCR分析表明,ChPSY基因在转化植株果实中得到表达。HPLC分析表明,转ChPSY基因番茄果实中总类胡萝卜素含量增加了1.62 ~ 3.04倍,八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素含量分别增加了4.87、2.10、2.59和3.25倍。转化植株中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。ChPSY基因超量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。 相似文献
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遮光性套袋对黄肉桃类胡萝卜素合成及相关基因表达的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
以‘金童6号’和‘金童8号’黄肉桃为试材,于花后60 d时套袋对果实进行遮光处理,研究遮光对果实叶绿素和类胡萝卜素积累的影响,以及类胡萝卜素合成关键基因的表达差异。结果表明：伴随果实成熟,叶绿素含量逐渐降低,且3个采样时期套袋果实中的叶绿素含量均显著低于不套袋的对照;类胡萝卜素含量逐渐升高,但未成熟期套袋果实低于对照,成熟期则显著高于对照。利用高效液相色谱（HPLC）对果肉类胡萝卜素组分的分析表明：在黄肉桃果实未成熟期,类胡萝卜素以叶黄素和β–胡萝卜素积累为主,表现出叶绿体合成途径特征;进入成熟期,有色体类胡萝卜素合成途径占据优势,形成更为稳定的酯化类隐黄质和紫黄质,并且套袋果实中酯化类胡萝卜素的积累水平明显高于对照果实。此外,分子证据表明伴随果实成熟,类胡萝卜素合成关键基因HDR（羟甲基丁烯基–4–二磷酸还原酶）、PSY1（八氢番茄红素合成酶1）、PSY2（八氢番茄红素合成酶2）、PDS（八氢番茄红素脱氢酶）和HYB（β–胡萝卜素羟化酶基因）在套袋和不套袋果实中均呈现上调表达趋势。值得注意的是,DXS（1–脱氧– D–木酮糖–5–磷酸合成酶基因）、PSY2和PDS基因在成熟期套袋果实中的表达水平低于对照,而HYB基因的表达水平显著高于对照。 相似文献
9.
为了构建番茄CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系，用SlU6-2p、SlU6-3p、SlU6-7p、SlU3-5p、SlU3-9p和SlU6-5p启动子分别替换pKSE401和pCBC-DT1T2载体中的拟南芥U6启动子，构建了1个双元载体（p MGET）、2个中间载体（pKC-S2M和pKC-S3M）和3个gRNA模块载体（pCBC-S1、pCBC-S2和pCBC-S3）。为了测试该多基因编辑体系，通过PCR扩增、Goldengate克隆和同尾酶技术，将含有6个番茄果实性状相关基因Green flesh(GF)、Ovate(O)、Locule number(LC)、SlMYB12(Y)、Tangerine(T)、Uniformripening(U)靶点序列的sgRNA聚合构建多基因编辑载体pMGET-OYGTULC和pMGET-TULCOYG，检测6个基因同时被编辑的效率分别为44.00%和11.76%。用携带pMGET-OYGTULC载体的根癌农杆菌转化番茄材料获得2株6个基因均被编辑的植株，序列变异为单个碱基的插入、单个或多个碱基的缺失及大片段的缺失等多种形式。本研究中该多... 相似文献
10.
基于NCBI数据库提供的番茄八氢番茄红素合成酶基因(PSY 1)全长,并根据基因序列中PAM(proto adjacent motif)的位置设计特异性sg RNA,构建CRISPR/Cas9 Level 1、Level 2载体;将设计好的载体转化农杆菌,继而转染番茄子叶,利用PCR产物测序法检测sg RNA在番茄基因组中的敲除效率。结果表明,36个转基因植株中有22个PSY 1基因目标区出现不同数目的碱基缺失、增加或互换,初步估计基因敲除效率为61%。本试验在番茄中初步建立了CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除。 相似文献
11.
成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已成为一种有价值的基因组编辑工具,能够在特定选择的位点改变DNA序列,可以在作物基因组的靶点位置精确地实现删除、替换或插入特定序列,引入理想的目标性状。该工具具有简单、高效、成本低以及功能强大等特性,在柑橘、葡萄、香蕉和草莓等果树中已实现多种类型的应用,包含产生白化表型、调控童期和花期、调控果实品质以及创造矮化和抗病虫害品种等。综述了CRISPR/Cas9系统及其作用过程,介绍了新开发的精准编辑技术,包括单碱基编辑器、引导编辑及CRISPR/Cpf1多基因编辑系统,并详细阐述了CRISPR/Cas9系统在果树基因组编辑中的应用进展,包括果树种类、目标基因及目标性状等,归纳了CRISPR/Cas9系统实现高效编辑所遇到的遗传转化和再生体系、脱靶效应和启动子选择问题,最后提出了不断优化遗传转化和再生体系、合理选择靶位点和设计sgRNA、植物内源启动子及新编辑技术的解决策略。 相似文献
12.
通过CRISPR/Cas9技术敲除SRK基因或者SP11基因可以直接将甘蓝类蔬菜自交不亲和材料改造成自交亲和材料。本研究中根据全基因组重测序获得青花菜(Brassica oleracea var.italic) BoSP11基因序列,构建双靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法对BoSP11进行敲除。结果显示,获得的29株转基因植株中有23株发生基因突变,编辑效率为79.3%。TA克隆测序结果表明有4株为纯合突变,19株为杂合突变。统计纯合突变T0代自交结籽情况发现花期自交亲和指数高达6.82,为目前所报道的能获得的亲和性最高指数。T1代植株在隔离大棚中通过蜜蜂授粉平均单株采收种子24.8 g,完全实现不需要人工干预完成亲本材料的自交繁育。 相似文献
13.
《食用菌学报》2020,(3)
根据CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)基因编辑技术,设计AbPPO4特异性导向RNA,构建双孢蘑菇(Agaricus bisporus)基因编辑载体pAbGEB1-AbPPO4,再通过农杆菌介导转化双孢蘑菇菌丝体建立基因编辑体系,观察菌丝生长状况。结果表明:获得12株转化子,1号和7号的菌丝体中存在潮霉素抗性基因,且AbPPO4基因的相对表达量较低,分别为0.28±0.04和0.47±0.02,与对照组相比,组间差异均具有统计学意义(P0.05),说明1号和7号转化子的菌丝体AbPPO4基因表达受到了抑制;与对照组相比,1号和7号转化子的菌丝体中AbPPO4基因均发生了突变,1号和7号分别产生了4 bp和11 bp的碱基缺失,证明设计的CRISPR/Cas9系统在双孢蘑菇内对AbPPO4基因成功地进行了编辑;同时发现AbPPO4基因突变后对双孢蘑菇菌丝体的生长产生了不利影响。 相似文献
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15.
以橙黄色果肉西瓜‘WM-Clr-2’及红色果肉西瓜‘PI 179881’为试材,采用HPLC法分析其番茄红素及β–胡萝卜素在7个发育时期的积累情况,同时采用q RT-PCR技术分析番茄红素和β–胡萝卜素代谢途径中8个关键酶基因(PSY1、PSY2、PDS、ZDS、CRTISO、LCYB、NCED1和NCED7)的表达量。结果显示,随着果实的发育,番茄红素和β–胡萝卜素含量均不断增加,且在同一时期,红色果肉‘PI 179881’中的含量始终大于‘WM-Clr-2’。q RT-PCR结果显示PSY1在‘PI 179881’中的表达量高于‘WM-Clr-2’,LCYB和NCED1在‘WM-Clr-2’中的表达量高于红色果肉‘PI 179881’。分析番茄红素及β–胡萝卜素的积累规律与相关基因表达规律说明PSY1的大幅上调表达,LCYB的下调表达及NCED1的低表达可能是红色果肉‘PI 179881’中番茄红素和β–胡萝卜素大量积累的主要原因。PSY1的低表达水平,LCYB和NCED1的高表达水平可能是橙黄色果肉‘WM-Clr-2’中番茄红素及β–胡萝卜素积累量少的主要原因。 相似文献
16.
以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。 相似文献
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为了研究β–胡萝卜素加酮酶基因在南瓜中合成酮基类胡萝卜素的功能,采用农杆菌介导瞬时表达技术,将含有衣藻β–胡萝卜素加酮酶基因CrBKT的pBI121-CMTPCRBKT载体和pBI121对照载体的农杆菌菌液注入授粉后2、5、10、15和25 d的南瓜果实中,3 d后观察发现,授粉后2和5 d的果实转化后果肉呈微红,其中授粉后5 d的颜色较深,而10 d以上的无红色色素积累。经高效液相色谱(HPLC)分析色素成分,发现积累的红色色素为酮基类胡萝卜素角黄素和虾青素。与对照相比,注入CrBKT基因的授粉后2和5 d的幼果中的类胡萝卜素含量显著增加,5 d的幼果约增加了1/3,且含有106.31μg·g~(-1)酮类胡萝卜素,其中角黄素占80.65%,虾青素占19.35%,而授粉后10 d以上的果实类胡萝卜素含量没有明显变化,也没有酮类胡萝卜素的积累。PCR扩增表明转化组织中表达了该基因。结果表明,CrBKT基因只能在授粉后5 d以内的幼果中表达,并将幼果中的类胡萝卜素转化为酮基类胡萝卜素;随着果实成熟,菌液在果肉组织中无法渗透而阻碍基因表达。 相似文献
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来自巴西和爱尔兰的研究人员称,他们正在使用CRISPR/Cas9基因编辑技术制造辣味番茄,这些番茄可以用来制作辣椒喷雾、麻醉剂和减肥药等。巴西维索萨联邦大学的阿古斯丁·泽斯哥恩和他的团队在近期出版的《植物科学趋势》中表示,像CRISPR/Cas9这样的基因编辑技术可以“唤醒”番茄中休眠的辣味基因。他们在努力进行制造辣味番茄的工作,希望在2019年年底之前有一些好消息。 相似文献
19.
根据NCBI中提供的番茄红素单碱基突变基因hp1和dg的序列,设计特异性引物.利用同一PCR反应体系同时扩增筛选番茄红素基因hp1和dg,以及野生型基因HP1和DG.结果表明:扩增的特异性片段与单基因引物扩增片段完全吻合.SNP分子标记为单显性标记,突变基因纯合体只在突变材料PCR体系中产生298和870 bp的特异性片段,野生基因纯合体只在野生材料PCR体系中产生298和870 bp的特异性片段,杂合体在2个反应体系中均有特异性片段.利用该体系在F2代中筛选出同时含hp1和dg基因的纯合植株,大大节省了工作量,提高了准确度. 相似文献
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番茄乙烯受体基因反义表达对果实成熟的影响 总被引：4，自引：0，他引：4
以乙烯受体基因LeETR1和LeETR2的转反义基因株系ale1和ale2为材料, 对果实成熟特性进行了研究。转基因番茄果实与对照相比, 呼吸速率下降, 但乙烯释放速率增加1～4倍, 呼吸高峰和乙烯跃变高峰出现的时间没有改变, 表明果实成熟起始时间没有改变。ale1果实成熟后期着色速度减慢, 红熟果色泽a值、番茄红素和类胡萝卜素含量都显著低于对照; 但果实多聚半乳糖醛酸酶活性上升和硬度下降速度都显著高于对照。这说明LeETR1基因与果实成熟品质特征的形成可能存在比较复杂的关系。 相似文献