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将黄瓜授粉前后多个发育阶段的幼果组织等量混合后提取总RNA和mRNA,以λTriplEx2为栽体、XL1-Blue为宿主茵,构建了1个黄瓜幼果cDNA文库;其滴度为1.165×106pfu/mL,重组率在94.4％左右.测序获得116条EST,92.2％的长度在400 bp以上,19％为重叠序列.在GenBank中进行BLAST分析后确认与已知功能基因相似的EST序列有71条,有相似序列而功能未知的基因和没有相似序列的EST序列各占19.83％和18.97％.从对文库的检验结果看,构建的cDNA文库重组率较高,库容达到预期要求. 相似文献
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《延边大学农学学报》2016,(4)
构建长白山药用真菌鸡爪苓菌丝体和子实体cDNA文库并测序,发掘鸡爪苓菌丝体和子实体发育中差异表达的基因;通过同源性比对,分析与陕西猪苓的亲缘关系,确立长白山鸡爪苓的分类地位。结果表明:鸡爪苓菌丝体和子实体cDNA文库滴度分别为1.504×1010 pfu/mL和1.094×1010 pfu/mL。从菌丝体cDNA文库选取500个克隆,经测序获得452个高质量表达序列标签(EST),序列拼接出的单一基因簇包含310个单一基因;从子实体cDNA文库中选取的500个克隆,经测序获得472个高质量表达序列标签,序列拼接出的单一基因簇包含350个单一基因。从菌丝体和子实体cDNA文库中发掘的单一基因簇中,分别有39.3%和35.4%的基因与已知功能基因具有同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、蛋白质合成、转录、抗逆反应以及能量代谢等。 相似文献
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LUO Hai-bin CAO Hui-qing WEI Yuan-wen DENG Zhi-nian PAN You-qiang GUO Yuan-yuan HE Hai-bo LI Yang-rui 《广西农业科学》2012,43(6)
[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95％,文库插入片段长度在500～2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5％和93.5％.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87％;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13％.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因. 相似文献
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[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500~2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5%和93.5%.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因. 相似文献
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亚洲棉（Gossypium arboreum L.）全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定 总被引：5，自引：0，他引：5
【目的】构建二倍体亚洲棉石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库,建立亚洲棉功能基因组学研究基础平台,发掘亚洲棉发育、抗逆等相关基因。【方法】取石系亚1号子叶期、苗期、蕾期、花铃期不同组织器官,提取总RNA并分离纯化mRNA,采用SMART技术反转录全长双链cDNA。用DSN（duplex-specific nuclease）法对全长双链cDNA进行均一化,均一化的cDNA连接到λZAPⅡ载体,包装蛋白包装后构建石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库。【结果】初级文库滴度4×106 pfu?ml-1,库容2×106个独立克隆,重组率大于95%,插入片段平均长度大于1.5 kb。随机挑取192个克隆进行EST（expressed sequence tags）测序,冗余度仅为3.49%。BLASTN比对结果显示：78.31%的EST为新EST。【结论】文库均一化效果良好,质量符合要求,可能包含大量新基因,是进行EST测序、发掘新基因等棉花功能基因组学的研究平台。 相似文献
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【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。 相似文献
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绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,降低纤维中存在的高峰度基因的拷贝数,提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。【方法】以优质陆地棉冀228开花后8-40 d纤维为材料,将纤维全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了棉花纤维的非剪切型全长cDNA原始文库。利用均一化技术获得均一化全长cDNA文库,进而测序获得大量的EST序列。采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接、比对、COG功能注释和GO注释。【结果】构建了优质陆地棉冀228纤维均一化全长cDNA文库,该文库初级文库库容为1.06×107,初级文库的滴度为3.56×106 cfu·mL-1,平均片段长度为1.2 kb。qRT-PCR检测均一化程度结果表明,棉花2个高峰度表达基因在该文库中的表达量均下降了1 000倍。随机选取2 384个克隆进行单向测序,获得2 169条高质量的表达标签（EST）,拼接成1 745个单一基因（Unigene）;同源比对分析表明,70%的Unigenes与已知功能基因具有较高的同源性。基因进行COG功能分类结果显示,较多的COG功能分类集中在“翻译、核糖体结构和生物转化”、“碳水化合物运输与代谢”和“翻译后修饰、蛋白转移及蛋白伴侣”功能上。根据基因的GO注释结果,参与细胞构成、细胞器和膜构成的基因比例最高,参与细胞过程和新陈代谢等过程的基因比例较高,具有结合和催化功能的基因较多,这些基因可能在棉纤维发育中发挥比较重要的作用。【结论】构建了优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,经文库质量检测、均一化程度检测和随机选取克隆的测序分析结果表明,文库的代表性和重组片段的完整性均达到了分离筛选目的基因的建库要求,整个文库有着很高的非冗余性。构建的cDNA文库具有既能获得与已知序列同源性很高的基因,又能挖掘出优质陆地棉冀228特有的基因或同源序列的作用,能够提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,将为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。 相似文献
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《延边大学农学学报》2015,(4)
以长白山鸡爪苓子实体为材料,采用Trizol改良法提取子实体总RNA,运用SMART技术构建鸡爪苓子实体全长cDNA文库。结果表明:原始文库的滴度为5.63×106 pfu/mL,重组率为98.73%;扩增后文库滴度为1.095×1010 pfu/mL,库容量约为2.19×1012。选取20个单克隆进行双向测序及分析,把成功获取的15条EST序列进行BLAST同源性比对分析,只找到了4条同源性序列,其余11条为鸡爪苓子实体新基因。 相似文献
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为了筛选中华绒螯蟹Eriocheir sinensis血细胞免疫的相关基因,促进蟹类免疫防治的进展,采用Gubler-Hoffman法构建了中华绒螯蟹血细胞的cDNA文库。结果表明：该文库初始滴度为4.50×106cfu/mL,库容为3.3×106cfu/mL,重组率为73%,插入片段大小多为800~2 500 bp。随机挑取了94个重组子进行测序初检,共得到93条平均长度为511 bp的表达序列标签（EST）序列,对所测EST序列进行拼接,得到75条一致性序列,包括15条重叠群（Contigs）和60条单一序列（Singleton）。对测序结果进行比对分析,获得了15条已报道有一定功能的一致性序列,其中4条与免疫相关;另外60条一致性序列还未见报道。研究表明,中华绒螯蟹血细胞cDNA文库已构建成功,且质量较高,从而为开展中华绒螯蟹功能基因克隆、分析和功能基因组学研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】深入了解棉花花药发育的分子机制,并为其不育机理的研究提供参考序列。【方法】构建棉花花药全生育期的均一化全长cDNA文库并测序获得9 896条高质量的EST,利用生物信息学和荧光定量相结合法对所得数据进行系统分析。【结果】该cDNA文库库容为1.2×107,插入片段分布在1—3 kb。将所测得的高质量EST进行拼接得到6 643条unigenes,平均长度为779 bp。经过序列比对注释和生物信息学分析,得到一系列在棉花花药发育过程中起重要作用的基因,并获得28条参与花粉壁合成的基因。荧光定量结果表明,这些基因均在花药发育前期优势表达,尤其是在四分体时期表达量最高。【结论】获得大量的棉花花药表达基因,并分析得到一些调节棉花花药发育的重要途径以及参与棉花花粉壁合成相关基因。 相似文献
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A full-length cDNA library from leaf and root tissues of cassava (Manihot esculenta) Arg7 and one accession of its wild ancestor W14 (M. esculenta ssp. flabellifolia) has been constructed. The library is comprised of four sub-libraries, containing 32640 recombinant clones, 6028 cDNA clones from their 5′ ends, and 128 clones from the 3′ ends were sequenced. In total, 5013 high-quality expressed sequence tags (ESTs) and 1259 unigenes were obtained. Of these, 746 unigenes were identified by their sequence homologies to ESTs from model plants, and 323 unigenes were mapped onto 114 different KEGG pathways. From these, 24 differentially expressed genes involved in starch metabolism and photosynthesis were identified and five of them were selected to compare their expression level between Arg7 and W14. Notably, Arg7 has a higher net photosynthesis rate in leaves, higher ribulose-1,5-bisphosphate carboxy-lase oxygenase activities in leaves, and higher AGPase activity in roots. This resource is the first EST collection from wild cassava and should be of value for gene discovery, genome annotation and studies of Manihot evolution. 相似文献
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用Gubler—Hoffman法构建了耐低温鲤Cyprinuscarpio脑组织全长cDNA文库,经测定库容量为5．7×10^5cfu／mL,文库的重组率接近95％,平均插入片段长度为1500bp,符合文库保存和筛选实验的要求。同时,根据鲤与低温相关的消减eDNA文库中低温下特异表达基因的片段序列,设计了PCR引物,并在此eDNA文库中进行PCR检测和序列测定。使用BLAST软件将测序的10个cDNA序列同GenBank等数据库进行比对,结果显示,8个阳性克隆有相关同源性,2个克隆为功能未知的基因,全长率接近75％。 相似文献
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正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1.2×106 PFU/mL、重组率为93.3%、85%插入片段处于750～2000 bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23.3% ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75.9% ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。 相似文献