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口虾蛄主要过敏原原肌球蛋白的免疫活性 总被引：1，自引：0，他引：1
原肌球蛋白(TM)是甲壳类动物的主要过敏原,其氨基酸序列具有很高的保守性。本研究以口虾蛄为研究对象,旨在探明TM是否是其主要过敏原并对其相关性质进行研究。利用过敏患者血清通过免疫印迹法确定口虾蛄的主要过敏原分子量约为36ku。通过制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵盐析及加热等方法纯化了该主要过敏原。采用抗中华绒螯蟹TM多克隆抗体进行免疫学性质分析表明该蛋白为TM。抑制性免疫印迹和抑制性ELISA实验表明口虾蛄TM与凡纳滨对虾和锯缘青蟹等甲壳类动物的TM具有较强的免疫交叉反应,但与贝类动物杂色蛤的免疫交叉性较低。通过ELISA方法对甲壳类动物的TM进行定量测定,结果表明,口虾蛄肌肉中TM的含量约只有凡纳滨对虾TM含量的1/45,但仍具有一定的致敏性。 相似文献
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锯缘青蟹蜕皮抑制激素cDNA的分子克隆及其表达分析 总被引：5，自引：1，他引：5
根据近缘种类同源序列设计简并引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术,首次扩增获得锯缘青蟹(Scylla serrata)眼柄组织中编码蜕皮抑制激素(MIH)成熟肽全长cDNA序列及部分信号肽序列。将该序列克隆到pUCm—T载体上进行序列测定。结果表明,编码锯缘青蟹MIH成熟肽的cDNA由234个碱基组成,由此推测MIH成熟肽含78个氨基酸残基。该序列不仅与其它短尾类甲壳动物的MIH氨基酸序列具有高度的同源性(79％～9l％),还与该激素同一家族的性腺抑制激素、大颚器抑制激素的氨基酸序列具有较高的相似性。RNA斑点杂交结果显示,MIH基因在眼柄神经节及脑组织中均有表达,而在肌肉、中肠腺中不表达。 相似文献
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采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,依据锯缘青蟹(Scylla serrata)几丁质酶基因的保守区设计引物,克隆了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)几丁质酶基因(HXchit)全长,并通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究了HXchit在中华绒螯蟹的同一蜕皮阶段不同组织、不同蜕皮阶段主要几个组织的表达情况。结果显示,HXchit基因c DNA全长2 042 bp(Gen Bank accession no.KJ513466),包括5′非编码区(5′UTR)35 bp,3′非编码区(3′UTR)537 bp,开放阅读框(ORF)1 470 bp,编码490个氨基酸,预测分子量和理论等电点分别为53.44 k D和4.41。经BLASTN和BLASTX分析,HXchit基因的氨基酸序列与锯缘青蟹几丁质酶的氨基酸序列同源性最高,相似性为75%;经聚类分析,HXchit氨基酸序列与锯缘青蟹几丁质酶聚为一支。q RT-PCR结果显示,HXchit在所检测的组织中均有表达,各组织的表达量依次为肝胰腺表皮肌肉胃鳃胸神经节肠心脏脑神经节。对不同蜕皮周期的中华绒螯蟹分析显示,肝胰腺中HXchit表达水平在D期最高,并与E期、AB期及C期呈显著性差异(P0.05);表皮中HXchit在E期、AB期、C期和D期的表达水平呈逐渐升高的趋势,D期表达量达到最高且与E期、AB期、C期呈显著性差异(P0.05);肌肉中HXchit表达量在C期最高,但各蜕皮时期的表达量之间差异不显著(P0.05)。结果表明HXchit是一种在中华绒螯蟹肝胰腺中大量表达的酸性几丁质酶,推测其在蜕皮周期中对几丁质类食物的消化或内源性几丁质的降解起到了重要作用,本研究旨在为进一步探索几丁质酶的准确生理功能和调控机制奠定分子基础。 相似文献
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克隆斑马鱼原肌球蛋白的基因并表达纯化出重组蛋白,对其免疫学特性进行鉴定。提取斑马鱼总RNA,采用RT-PCR克隆斑马鱼原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增斑马鱼原肌球蛋白基因的完整开放阅读框,连入载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中通过IPTG诱导得到重组斑马鱼原肌球蛋白。重组蛋白经Ni 2+亲和层析柱纯化后进行Western-blot检测。获得斑马鱼原肌球蛋白基因,Western-blot结果显示重组蛋白具有良好的免疫活性。本研究成功克隆并表达了斑马鱼原肌球蛋白基因,经免疫学鉴定发现其具有过敏原性。 相似文献
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锯缘青蟹(俗称黄格蟹)是畅销国内外市场的高档水产品之一.自2002年起,上虞市渔民在海涂九六丘北塘外陆基围塘养殖锯缘青蟹,至今养殖面积已达4000余亩.2006年市近海特种水产养殖基地在陆基围塘锯缘青蟹养殖中采用生态养殖技术,当年养殖的锯缘青蟹平均规格达265克以上,其中300克以上的锯缘青蟹占30%,该锯缘青蟹品质好,肉质鲜美,深受广大消费者所喜爱. 相似文献
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采用RACE技术克隆获得总长为1 712 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白基因全长cDNA序列,命名为PtAQP基因.该基因5'和3'非编码区分别为153 bp和788 bp,开放阅读框为771 bp,推测编码256个氨基酸,预测分子量为27.0 kD,理论等电点为8.26.生物信息学分析表明,PtAQP含有6个跨膜区和2个NPA单元,具有与MIP家族匹配的保守氨基酸序列,属于稳定蛋白;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列与可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％),与可口美青蟹紧密聚为一支;荧光定量RT-PCR分析表明,PtAQP基因在各组织中均有表达,而在胃中的相对表达量最高.通过分析PtAQP基因在盐度胁迫中的表达规律发现,盐度胁迫可显著改变PtAQP基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.该研究结果表明,PtAQP基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用. 相似文献
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应用PCR方法检测患“黄水病”锯缘青蟹中的血卵涡鞭虫 总被引：3，自引：0，他引：3
"黄水病"是目前锯缘青蟹养殖过程中的主要疾病之一,病蟹主要症状表现为肌肉白浊,体液呈土黄色或浊白色牛奶状。因该病流行范围广、发病率和死亡率高,给青蟹养殖业主造成巨大经济损失,严重地影响了青蟹养殖的健康发展。本研究从病蟹体液中发现大量疑似血卵涡鞭虫的寄生原虫,应用已建立的梭子蟹血卵涡鞭虫病的PCR检测方法对患"黄水病"青蟹进行检测。结果从患病青蟹组织的DNA中扩增出产物大小为585bp的特异性目的片段,经序列分析比较,与三疣梭子蟹上发现的血卵涡鞭虫的序列同源,同源性达99.7%。综合病原流行病学调查、组织病理学、电镜观察等分析结果,初步确定血卵涡鞭虫是引起养殖青蟹"黄水病"的重要病原。 相似文献
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弧菌(Vibrio)不仅对海水网箱养鱼业、养虾业造成危害,也对锯缘青蟹养殖业造成较大影响。近年来,我们曾多次从病、死蟹、甚至蟹苗体内分离出多种致病性弧菌,尤其是对虾、蟹、蚝等甲壳类有明显感染致病性的溶藻弧菌(V．alginolyticus)、 相似文献
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三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析 总被引：1，自引：1，他引：0
基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。 相似文献
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锯缘青蟹俗称青蟹、虫寻、蝤蛑。属节肢动物门、甲壳纲,十足目,爬行亚目,短尾派,梭子蟹科,青蟹属,是我国珍贵的水产品之一。锯缘青蟹在我国主要分布在广东、广西、福建、台湾、浙江等省沿海。其肉味鲜美独特,营养极为丰富,食用药用价值高,尤其是交配后性腺成熟的雌性蟹(红虫寻、膏蟹)有海中人参之美誉,是产妇、老幼和身体虚弱者的高级滋补品,蟹壳可制成甲壳素,是一种用途广泛的工业原料。锯缘青蟹以肉食性为主,喜欢寻食小杂贝、小杂螺、小杂鱼、小杂虾及小杂蟹等。锯缘青蟹又是广盐性的海产蟹,其养殖的适宜盐度为7‰~33‰,最适是10‰~20‰,… 相似文献
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为实现甲壳类水产品主要过敏原的快速检测,实验使用凡纳滨对虾原肌球蛋白(TM)作为检测靶标,构建了胶体金免疫层析检测方法。使用天然TM分别免疫SD大鼠和新西兰大白兔制备多克隆抗体,以40 nm胶体金标记的鼠多抗作为检测抗体,以兔多抗为捕获抗体,基于双抗体夹心原理组装免疫层析试纸条,并应用于市售食物样品的检测。结果显示,组建的免疫层析试纸条可在5 min之内显示结果,视觉检出限为10 ng/mL,对虾、蟹、克氏原螯虾及美洲螯龙虾等甲壳类水产品的特异性高,但与蛤蜊、扇贝存在微弱的交叉反应;在不含甲壳类水产品的市售食品中的加标回收率为81%～126%,准确性良好;试纸条的批内、批间变异系数低于15%,市售实际食物样品的检测结果与食物过敏原标签一致。研究表明,该方法具有高灵敏度与检测特异性,可在多种基质与商业化食品中实现甲壳类过敏原的有效检测,具有较强的实际应用价值。 相似文献
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中华绒螯蟹精巢特异表达蛋白DMRT-like:抗体制备及免疫鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
Dmrt是性别调控因子Doublesex和Mab-3的相关基因,近年报道了中华绒螯蟹EsDmrt-like只在精巢中表达,为了验证EsDMRT-like蛋白是否在中华绒螯蟹精巢中特异表达及其功能,根据中华绒螯蟹EsDmrt-like基因序列,构建重组质粒pET-32a-EsDmrt-like,转化大肠杆菌BL21,经融合表达和SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为46ku.利用Ni柱亲和纯化融合蛋白免疫家兔,制备获得EsDMRT-like多克隆抗体.Western-blotting检测表明该抗体既能特异地识别重组蛋白,又能特异识别精巢中EsDMRT-like蛋白,并且该抗体仅在精巢中检测到EsDMRT-like蛋白的表达,分子量约为52 ku,为预期单体分子量的二倍.Western-blotting检测变性后精巢总蛋白,该抗体能识别52和34 ku两条条带,证明了二聚体的存在.这一结果暗示EsDMRT-like可能通过形成二聚体形式调控中华绒螯蟹精巢发育. 相似文献
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利用RT-PCR方法扩增出IPNV-ZYX分离株主要结构蛋白VP2的抗原表位区基因(616 bp), 命名为IPNV VP2 COE, 将其克隆到pCold TF表达载体中构建重组质粒pCold TF-VP2 COE, 在大肠杆菌BL21(DH5α)感受态表达, 经SDS-PAGE电泳分析, 表达蛋白约78 ku, 用镍离子亲和层析柱纯化该蛋白, 制备抗血清, 间接ELISA结果显示, IPNV (ATCC VR-1318)细胞培养物与鼠抗VP2 COE蛋白血清发生特异性反应, 效价为1∶12 800; 间接免疫荧光结果显示, 鼠抗VP2 COE血清可与黑龙江某渔场已知感染IPNV虹鳟肝组织产生特异性的荧光, 以上两项结果表明, 表达IPNV VP2 COE蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性, 为IPNV检测方法的建立及疫苗的制备提供理论依据 相似文献
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应用反向高效液相色谱法(RP-HPLC)从中华绒螯蟹脑组织提取液初步分离了促性腺释放激素(GnRH)类似物,使用章鱼促性腺释放激素抗体(anti-octGnRH)对分离组分进行免疫斑点印迹实验鉴定,获得了免疫反应呈阳性分离组分,表明脑组织粗提液中含有GnRH类似物分离组分。对该GnRH类似物进行基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOFMS)分析,结果显示多肽物质分子量范围在800～1400u,主要由8种小分子多肽组成,其中一种组分的分子量与章鱼促性腺释放激素(octGnRH)分子量接近。 相似文献
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扩增中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢EJO1基因(GenBank检索号:AY185917)的cDNA全序列得到编码区序列,并将其插入原核表达载体pET28b中,构建成表达质粒pET28b-EJO1。该表达质粒在大肠杆菌(Esche-richia coli)BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到EJO1-H IS6融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该融合蛋白的相对分子质量约为32 000。经镍离子柱亲和层析进一步纯化得到纯度较高的EJO1-H IS6融合蛋白。 相似文献
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扩增中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）卵巢EJ01（GenBank检索号：AYl85917）的cDNA全序列得到编码区序列，并将其插入原核表达载体pET28b中，构建成表达质粒pET28b-EJ01。该表达质粒在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，得到EJ01-HIS6融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明，该融合蛋白的相对分子质量约为32000。经镍离子柱亲和层析进一步纯化得到纯度较高的EJ01-HIS6融合蛋白。 相似文献
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鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达 总被引：5，自引：0，他引：5
A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene (omp) of Aeromonas hydrophila . With the specific primers, a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR .The target fragment was inserted into the linearized pGEM-T easy vector. After enzyme restriction and sequencing analysis,the nucleotide data had been further analyzed by DNAman and ClutalW software. The analysis results showed that the cloned DNA fragment had a longest open reading frame (ORF) of 1035 nt,it predicted to be encoded a 344 aa protein with the molecular weight of 36 kD. Hydrophobicity analysis suggested that the protein was highly hydrophilic, especialy at the first 24 aminoacid, this region could function as signal peptide. The homologious comparison proved the cloned gene had 96% homology to the sequence of the omp gene, and the alignment of the amino acid sequence was 98% . The recombinant plasmid was constructed with the target gene and the expressing vector pGEX-4T-1 and then was transformed into E. coli BL21（DE3）by BamH and Sal I .The fusion protein was expressed under the IPTG inducing condition,and exhibited about 62 kD in size,very close to the predicted molecular weight of GSTMOMP, furthermore,the fusion protein was specifically recognized by antiserum which raised against the major outer membrane protein of AHML316. Considering all these together, it proved that the cloned gene represented the major outer membrane protein gene of AHML316, and the expressed gene products shared identical antigenicity with the natural main outer membrane protein,and also provided technical support for developing an advanced gene engineering vaccine against Aeromonas hydrophila. 相似文献