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1.
转基因小鼠生产过程的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
以昆明小鼠作为制备转基因小鼠的供、受体，优化了转基因小鼠生产过程中的显微注射和移植过程，调整了对大小不同的DNA的注射浓度和受体鼠的选择标准。结果使转基因效率从10％上升到20％以上；并得出DNA的大小与注射浓度的最适结合点为大于10kb的DNA，浓度应控制在2～3μg／mL。 相似文献
2.
原核注射技术已经是目前制备转基因小鼠(Mus musculus)最有效的手段,但不同实验室所报道的转基因效率差异较大,效率不高仍是该技术的主要缺点.为提高转基因小鼠的制备效率,本研究对转基因小鼠制备过程中的原核注射的多个方面都进行了改进,尤其是在注射针直径、外源基因浓度、单/双原核注射以及胚胎移植等主要步骤上的进行了优化.实验结果表明,不同浓度的外源基因对转基因小鼠的阳性率有很大影响.外源基因为1.00、2.50、3.00和4.00 μg/mL浓度时,转基因小鼠阳性率分别0.67％、14.9％、30.6％和21.4％.其中,外源基因浓度在3.00 μg/mL极显著高于其他各组(P＜0.01).采用阳性率最高的3.00 μg/mL浓度又进行了单双/原核注射比较,发现转基因阳性率在进行双原核注射组显著高于单原核注射组(24.3％ vs.18.3％,P＜0.01).将显微注射后的2细胞时期胚胎经输卵管移植到0.5、1.5和2.5d假孕母鼠体内,产仔率分别为68.6％、67.6％和40.1％,转基因阳性率为17.4％、22.5％和10.1％.比较发现,0.5 d与1.5d代孕母鼠产仔率没有差异,但1.5d代孕组转基因阳性率(22.5％)显著高于其他组.结果表明,采用尽可能细的注射针、2～4 μg/mL的DNA载体浓度、双原核注射、1.5d的假孕母鼠和正确的胚胎移植操作,是获得高效率转基因小鼠的关键.本研究对从事动物转基因技术研究的实验室提供一些有益的借鉴. 相似文献
3.
人肥胖基因(Obese)转基因小鼠动物模型的建立 总被引：7，自引：1，他引：6
用三个含有兔乳清酸性蛋白基因(rWAP)启动子,人ob基因(cDNA)及rWAP基因终止子的质粒经亚克隆构建了融合表达载体.用NotI消化表达载体,回收包含上述三个表达元件且插入方向正确的片段(约7.5 kb)并进行显微注射.注射用的DNA浓度为2 g/mL,每mL注射液中DNA的拷贝数约为2.4??011 ,每一枚原核期小鼠胚胎注射1～2 pL.采用标准的显微注射方法,获得48只后代小鼠.四周龄时剪尾并提取尾组织DNA,以人ob基因cDNA为探针,用EcoRI消化总组织DNA,经Southern杂交确证其中两只母鼠为转人ob基因小鼠.在出生的后代小鼠中,转基因阳性率约为4 %(2/48). 相似文献
4.
以CMV-PAAV载体为基础载体,以皮肤特异人K14（人角蛋白14）基因启动子替换原质粒中的CMV启动子后,在其多克隆位点区依次插入鼠c-Myc基因的cDNA序列和gfp基因的编码序列,构建了高效表达c-Myc基因的真核表达载体。通过双原核显微注射技术,将线性化的载体DNA注入到C57BL/6小鼠受精卵的两个原核中,然后将注射后状态良好的胚胎移植到代孕鼠的输卵管中,共移植了256枚受精卵,6只受体怀孕,最终获得44只成年小鼠。通过PCR和Southern blot分析证明2只为阳性转基因小鼠,转基因阳性率为4%。Southern杂交结果分析显示外源片断是以多拷贝串联重复的形式整合到鼠染色体中 相似文献
5.
采用牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对牛精子胞质内注射（ICSI）介导转基因效果的影响。结果表明：线性pEGFPN1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL组（19.8%,16.7%VS 7.9%,p〈0.05）。以冻融、TritonX100、超声波断尾三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率（24.7%）最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组（41%VS 20.5%,p〈0.01）;当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异（p〉0.05）,但二者之间胚胎的基因表达率差异显著（46.83%VS 28.57%,p〈0.05）。以上结果表明：（1）牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA会影响胚胎发育;（2）精子质膜是阻碍外源DNA与牛精子相结合的主要因素,将精子冻融处理可有效破损其质膜,利于精子与外源DNA的结合,从而提高ICSI介导转基因效率;（3）25℃和38℃热台温度对牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但25℃热台温度可提高牛ICSI介导转基因的效果。 相似文献
6.
以pEGFP-N1质粒为基础载体,切除gfp基因的编码序列后,在多克隆位点依次插入动物肌肉α-actin启动子和棉花ω-6脂肪酸脱氢酶编码基因fad2(fatty acid desaturase-2)的cDNA序列,构建成fad2cDNA真核表达载体.用显微注射方法,将线性化的载体DNA注入KM ×B6D2F1小鼠受精卵的的原核内部,然后将胚胎移植到输卵管内,13只受体怀孕产仔.合计移植了286枚受精卵,最后获得34只健康的成年小鼠,PCR方法检测确认5只为阳性小鼠,Southernblot证明只有1只阳性转基因小鼠. 相似文献
7.
一种适于转基因番茄检测的高效稳定的DNA提取方法 总被引：14，自引：0，他引：14
本研究介绍了一种稳定而高效的番茄DNA提取方法。该方法所提取的DNA不但纯度高，而且浓度大，产率达到0.23%，简便易得。可用于对转基因番茄进行稳定而准确的PCR检测。 相似文献
8.
通过在不同模板DNA浓度(0.2～16 ng/μL)、不同转基因含量(0.05%～50%W/W)以及不同模板存放温度(22℃、4℃和-20℃)和存放时间(1、2、3周和1,3个月)条件下进行转基因水稻外源成分的定性PCR检测,发现当模板浓度在0.4 ng/μL以上时所有引物均能扩增出目标片段,对于转基因含量为1.0%和0.1%的混合样品,能稳定检测出转基因成分所需的DNA最低浓度分别为1和2～4 ng/μL.模板DNA的不同温度存放条件对检测没有明显影响,长时间存放后PCR扩增产物条带亮度有所减弱. 相似文献
9.
在转CBF1基因烟草的后代中发现了花器官变异的植株，主要有花瓣裂瓣、花型变小、花丝变短花粉萌发率降低和育性降低等表型变化。采用TAIL－PCR方法，从花器官变异明显和不明显的植株中分别克隆到了各自的T－DNA插入区域的侧翼序列。将这些侧翼序列与GenBank database及pBI121质粒进行比对。结果表明表型差异明显的2个植株的T－DNA插入位点相同，属于一个转基因株系；且T－DNA插入区位于烟草基因组的非编码区。说明这些花型的变异并非由T－DNA在受体基因组中插入位点不同造成的，也不是由外源转基因对受体功能基因的破坏引起的。 相似文献
10.
11.
利用转基因小鼠表达法氏囊病毒A片段的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要： 将法氏囊病毒(IBDV)A片段定向连于乳腺特异性表达载体p7GMB53, 用于转基因实验, 用PCR和Southern杂交对阳性小鼠及其后代进行检测。 共注射了879枚小鼠受精卵, 移植受体26只, 产仔39只。 经PCR检测阳性6只（其中2只死胎）,Southern杂交检测确定了2只阳性小鼠(1公1母)。外源基因整合的拷贝数分别为3拷贝（公）和9拷贝（母）。将两只阳性小鼠进行了传代,实验表明二者分别为种系纯合体及种系嵌合体。 ELISA 及Western blot检测认为阳性母鼠表达了IBDV 衣壳蛋白。初步验证了先前构建的含基质附着区序列（MARs）的乳腺表达载体能克服转基因的位置效应,实现转入目的基因的表达,提高乳腺反应器的制备效率。 相似文献
12.
我国是蜂蜜生产大国,棉花是主要蜜源植物之一。近些年来,我国种植的棉花大多为转基因抗虫棉,棉花蜜中是否含有转基因成分,引起国内外广大消费者的密切关注。本文以抗虫棉种植地采取的棉花蜜为原料,采用改良CTAB法,在DNA提取过程中,用PBS缓冲液除去其中大部分的可溶性多糖,并提高CTAB提取缓冲液中NaCl浓度以去除残余多糖,从蜂蜜中成功提取出片段完整、纯度较高的DNA,DNA得率为486ng/mL,OD260/OD280为2.01,能够满足后续PCR定性检测的需求。从以转基因棉花为蜜源的蜂蜜中检测出外源DNA片段,建立了蜂蜜中转基因成分的PCR检测技术。本研究对转基因食品标识制度的完善、转基因食品监管、减少贸易摩擦以及保证消费者权益等具有重要意义。 相似文献
13.
本研究从人乳铁蛋白（hLF）cDNA转基因小鼠乳汁中提取重组人乳铁蛋白（rhLF）,并用提取的rhLF进行抗菌活性分析。收集了2个基因和2个品系的（PCL25和AP基因）转基因小鼠乳汁,采用凝胶过滤层析法从转基因小鼠乳汗中提取rhLF,提取物通过SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析,ELISA检测提取物中rhLF含量;按不同浓度rhLF作琼脂扩散抑制大肠杆菌、沙门氏菌试验。结果表明,通过凝胶过滤层析获得的PCl25和AP转基因小鼠乳汁中的rhLF分子量为78KDa,与天然人乳铁蛋白一致,rhLF对大肠杆菌、沙门氏菌均具有明显的抑菌作用。 相似文献
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成纤维生长因子18(fibroblast growth factor 18,Fgf18)是一种分泌型的信号分子,参与小鼠(Mus musculus)和绒山羊(Capra hircus)毛发生长及毛周期的调控.本研究克隆了小鼠Fgf18基因CDS区的片段,并将其连接于超高硫角蛋白(ultra-high sulfur keratin,UHS)启动子的下游.Sac Ⅰ、BglⅡ、SphⅠ和EcoT14 Ⅰ的酶切鉴定结果表明,成功构建了Fgf18基因毛囊特异表达载体pUHS-Fgf18.原核注射线性化pUHS-FGF18,共获得3只转基因小鼠.RT-PCR检测结果表明,Fgf18基因在转基因小鼠皮肤中的表达明显高于对照小鼠(P＜0.05).转基因小鼠NO.205皮肤中Fgf18的表达量明显高于对照小鼠(P＜0.05),而肝脏、肾脏、心脏、睾丸、骨骼肌、脾、脑、肺、胃和小肠等组织则与对照小鼠无显著性差异(P＞0.05).Westem blot的结果表明,转基因小鼠皮肤的Fgf18蛋白水平显著高于对照组(P＜0.05).同时本研究利用RT-PCR的方法检测了转基因小鼠中Fgf18基因的拷贝数,其拷贝数在8～210.本研究成功建立了毛囊特异表达Fgf18基因的转基因小鼠模型,不仅可为进一步研究Fgf18基因在毛周期及毛发生长中的功能及其作用机理提供必要的工具和手段,也可为生产Fgf18基因修饰的转基因绒山羊提供一定的理论基础. 相似文献
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用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性 总被引：12，自引：0，他引：12
利用本实验室研制的植物DNA提取试剂盒，从玉米（Zea mays）种子中提取符合PCR检测要求的DNA。根据不同转基因玉米中重组DNA的结构，分别设计引物，可对Btl1、Event176、T25、MON810、GA21和NK603等6种转基因玉米进行特异性PCR检测。在此基础上建立了针对6种转基因玉米的特异性DNA片段和玉米内参照基因（zein）的复合PCR检测方法，能同时对7对引物进行扩增，通过产物的长度差异对不同的转基因玉米进行辨别，实现了在同一个PCR反应管中同时对6种不同转基因玉米的特异性检测。 相似文献
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转基因水稻Bt汕优63的整合结构和品系特异性定量PCR方法 总被引：4，自引：0，他引：4
为更好地监测转基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)Bt汕优63品系的存在,满足转基因标识管理的要求,同时也为了解决阳性植物基因组DNA不容易获得的问题,本研究采用热不对称交互PCR(TAIL-PCR)、Genome Walking和长链PCR(LD-PCR)方法测定了基因枪转化的转cry1Ab/cry1Ac融合基因水稻品系Bt汕优63的外源插入DNA全序列,构建了含有Bt汕优63 3′旁侧和水稻内标基因gos9序列的标准质粒分子pMDBt63作为标准物质,建立了Bt汕优63实时荧光定量PCR方法.外源插入DNA全长9 818bp,位于水稻基因组10号染色体(AP008214)第5348630位,由8个来源于两个转化质粒的DNA片段组成,其中两个cry1Ab/cry1Ac表达框以正向串连的方式插入.gos9和3′旁侧两个定量标准曲线的相关系数(R2)分别为0.9997和0.9992,扩增效率(E)分别为98.05%和99.46%.每反应100 ng模板DNA的检测限(LOD)为10拷贝,定量限(LOQ)为100拷贝.此外,对已知5%和1%转基因含量的混合样品DNA进行定量检测,结果的平均值分别为4.98%和1.07%.结果表明标准质粒pMDBt63作为标准物质建立的定量方法可用于Bt汕优63的定量检测. 相似文献
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外源DNA导入普通小麦雄性不育变异体的花粉母细胞减数分裂观察 总被引：4，自引：1，他引：4
将外源λDNA导入受体普通小麦品系 81 45 2 7,获得一雄性不育变异体。对该不育变异体和受体花粉母细胞减数分裂过程进行观察。结果发现 ,不育变异体花粉母细胞染色体异常比率达到 1 8% ,而受体花粉母细胞染色体异常比例为 0 8% ,二者存在明显差异。染色体异常类型主要有单价体、染色体落后、染色体断片、染色体桥、微核及二分体、四分体异常等。染色体异常可能是外源DNA导入受体后 ,整合进受体染色体中的DNA片段影响其正常的遗传过程而造成的。花粉母细胞减数分裂过程染色体异常可以引起部分花粉败育 ,但不是该变异体败育的主要原因 相似文献
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用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品* 总被引：26，自引：2，他引：26
用从转基因大豆(Glycine max)颗粒中提取的DNA作为模板,经过稀释,形成不同浓度梯度的DNA溶液,然后用巢式和半巢式PCR进行扩增反应。结果表明,巢式和半巢式PCR均可以扩增DNA浓度为10^14g/μL的溶液。用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测,可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(housekeeping gene)。其中,2种食品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出外源基因CaMV35S-CTP4基因片段,说明这些食品中含有转基因大豆成分,占被检测食品的76．5％。用巢式PCR和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready和其深加工食品是一种有效的方法。 相似文献
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以川棉（Gossypium hirsumm，)239胚性愈伤组织为受体，用基因枪轰击法导入外源基因，获得了经Gus组织染色和PCR扩增鉴定的转基因植株。以gus基因瞬时表达蓝点数为评价指标，考察了影响基因枪转化棉花胚性愈伤组织的几个因素，结果表明：使用碱裂解法提取和PEG法纯化的质粒DNA，优于试剂盒大量提取的DNA；当轰击压力为10．7MPa时，轰击距离6或9cm较好；轰前经1-2周培养的愈伤组织较佳。实验还表明，玉米的Ubi启动子在棉花胚性愈伤组织中有启动活性。轰击后直接用100mg/L的卡那霉素进行筛选优于梯度筛选。 相似文献
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转基因玉米NK603基体标准物质研制 总被引：1，自引：0，他引：1
由于转基因标准物质的缺乏,无法保证检测结果的准确、可靠和可比。本研究将筛选后的转基因玉米(Zea mays)NK603 阳性材料及受体进行研磨筛分,粒径测定结果表明,研磨后的粒径大小为 100 μm左右。采用重量法配置了 3 个不同水平的转基因玉米基体物质,应用实时荧光定量 PCR 方法对研制的标准物质进行均匀性和稳定性检测,统计结果表明,所研制的基体标准物质均匀性良好;在 4 ℃保存条件下,一年内未发现不稳定现象。重量法确定的标准值和扩展不确定度(k=2)分别为(0.50±0.10)%、(1.00±0.35)%和(5.00±0.35)%。同时选择 7 家实验室进行协同验证,结果表明,研制的转基因玉米 NK603 基体标准物质量值准确可靠,与国外标准物质相比,不确定度水平相当。本实验研制的转基因玉米 NK603 基体标准物质适用于转基因玉米 NK603 的定量检测。 相似文献