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1.
利用PCR方法从鸭坦布苏病毒山东分离株(BZ株)扩增整个E基因,全长1 503 bp,克隆到pMD18-T载体中,然后将双酶切目的片段亚克隆入pET-28a(+)载体,构建出重组表达质粒PET28a-E。将PET28a-E转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导可表达出分子量约54.8 kD的蛋白,Western blotting试验呈阳性,表明E蛋白有很好的反应原性。以纯化的表达产物作为包被抗原,鸭坦布苏病毒血清为一抗,HRP标记的羊抗鸭IgG为二抗建立间接ELISA方法。采用该方法对80份送检鸭血清进行检测,并与中和试验进行比较,结果显示,两者的符合率为95.0%,表明该方法具有较好的应用前景。 相似文献
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重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子 总被引：1，自引：0，他引：1
【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。 相似文献
3.
《浙江农业学报》2015,(11)
为开展鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联苗的研究,将密码子优化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因插入转移载体p EP-BGH-end构建了p EP-BGH-E重组表达质粒。在鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体(p DEVvac)的基础上,首先通过Red E/T两步重组法构建了EF1启动子替换GFP基因CMV启动子的p DEV-EF1突变体克隆,并将p EP-BGH-E质粒上的重组表达框p CMV-E-BGH-p A再次通过两步重组克隆至p DEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带有外源基因DTMUV E的突变体克隆p DEV-E。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)获得了重组病毒r DEV-E。病毒蚀斑大小测定结果显示,r DEV-E在CEFs上的蚀斑面积较亲本株相比稍有减少。Western blotting分析表明,外源蛋白E在病毒感染的CEFs细胞中成功表达。 相似文献
4.
甲基转移酶(methyltransferase,MTase)是鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白5的重要功能基团,在病毒复制及致病过程中发挥重要作用.为了对鸭坦布苏病毒甲基转移酶进行真核表达,并对其生物学功能进行鉴定,以GenBank中收录的DTMUV JS804株基因序列为模板,设计针对MTase的特异性引物,提取TMUV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板进行扩增,得到MTase的基因片段,然后亚克隆至pCMV-Flag真核表达载体中,构建重组质粒pCMV-Flag-MTase,提取去除内毒素的重组质粒,并转染至BHK-21细胞,通过间接免疫荧光观察和Western Blot鉴定该蛋白的表达.结果显示,质粒pCMV-Flag-MTase经双酶切鉴定证明构建正确,通过间接免疫荧光与Western Blot检测,重组质粒在BHK-21细胞内正常表达,表达的蛋白与天然坦布苏病毒MTase具有相同的反应原性. 相似文献
5.
[目的]拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础.[方法]取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用.[结果]DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70).含重组质粒pET32a-HSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应.以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染.[结论]HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计. 相似文献
6.
在对鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位分析的基础上,将已经筛选出的8条抗原性良好的多肽采用柔性肽拼接,转入T载体中。将酶切回收的串联基因(命名为TEM)克隆于表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-TEM,将该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导后进行超声裂解,对融合蛋白进行可溶性分析、Western blotting分析和免疫原性分析。重组质粒p ET32a-TEM的酶切和测序结果表明,TEM串联基因已成功插入到p ET32a原核表达载体中;表达的p ET32a-TEM融合蛋白分子质量约为38 000,以包涵体形式存在。Western blotting和小鼠免疫试验结果显示,p ET32a-TEM融合蛋白与鸭坦布苏病毒阳性血清能发生特异性反应,具有良好的抗原性。串联多肽的成功表达,将为鸭坦布苏病血清学检测方法建立、新型工程疫苗的研发奠定基础。 相似文献
7.
在大肠杆菌中表达鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV) 奉贤株的主要结构蛋白E。本研究利用RT-PCR方法扩增出E基因, 将其克隆至原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-E。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白成功获得了表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子量为63 ku。Western blot分析表明,该蛋白能与抗His标签的鼠单克隆抗体发生特异性反应。以上结果表明,在大肠杆菌中成功表达了DTMUV主要结构蛋白E。 相似文献
8.
自肝脏表现不规则出血的白羽半番肉鸭脏器中分离获得1株病毒(命名为ZZ40株),经(RT-)PCR检测为鸭坦布苏病毒,可被鸭坦布苏病毒高免阳性血清特异性中和。应用鸭坦布苏病毒特异性引物从该株病毒基因组中成功获得结构蛋白基因片段,该片段与近年来我国分离的禽源坦布苏病毒株核酸序列同源性均在99.1%以上,而与蚊媒源坦布苏病毒MM-1775株同源性仅为88.6%;分子进化分析表明该株病毒与BYD-1等近年来的鸭坦布苏病毒分离株共处于一个进化分支。以上结果表明,我国白羽半番肉鸭存在坦布苏病毒感染,且该分离毒株的抗原性与我国早期分离于种(蛋)鸭的坦布苏病毒差异不明显。 相似文献
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10.
《浙江农业学报》2015,(10)
通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-NS5,经双酶切鉴定及测序正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白最终经SDS-PAGE及Western-blotting鉴定。结果显示,NS5融合蛋白分子质量约为120 ku,在诱导后5 h达到表达量高峰,融合蛋白以包涵体形式存在,Western-blotting显示原核表达的蛋白可被兔抗鹅坦布苏病毒血清特异性识别,表明以NS5蛋白为抗原制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性。 相似文献
11.
室内测定了丙草胺分别与磺酰脲类除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、醚磺隆和吡嘧磺隆混用后，一叶一心期稻苗抑制50％株高的使用浓度(IC50)和抑制10％株高的使用浓度(IC50)，并用共害系数(CHC)对混用组合安全性的联合作用进行了评价．结果表明：所有混配处理的CHC10均小于12．0，表现出强烈的解毒效应；不同混用处理的CHC50值差异很大，丙草胺与甲磺隆混用的CHC50均小于25．0，解毒效应显著．丙草胺与苄嘧磺隆混配的CHC50为26．1—167．8，丙草胺与苄嘧磺隆混用的CHC50为52.2—115.5，丙草胺与醚磺隆混用的CHC50为80．0—110．2． 相似文献
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试验研究了0~8周龄肉仔鸡胴体与羽毛蛋白、脂肪的生长曲线及0~3、4~6和7~8周龄3个阶段每日摄入不同水平的能量及蛋白对其体蛋白、体脂肪沉积的影响,旨在确定胴体与羽毛蛋白、脂肪动态的沉积规律及日粮能量沉积为体蛋白及体脂肪的效率。试验1,包括3个饲养试验分别选取体重相近的0、21和42日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡324只,按性别及日粮随机分为18个处理,每处理3个重复,每重复6只鸡。肉仔鸡每日限量饲喂,饲喂水平分别为正常采食量的90%、70%和50%,每日定量供给肉仔鸡高、中、低3个水平的高蛋白质基础日粮及由饲喂水平决定的定量淀粉,进而使肉仔鸡每日采食能蛋质量比(代谢能/粗蛋白)不同的9种日粮;试验2,选取体重相近的0日龄AA肉仔鸡144只,按性别不同随机分为2个处理,每处理4个重复,每重复18只鸡。试验初和试验末分别进行屠宰,以测定肉仔鸡胴体和羽毛蛋白、脂肪和干物质含量。结果显示:1)Gompertz方程能很好的拟合不同性别肉仔鸡蛋白和脂肪的生长,不同性别间蛋白和脂肪极限重量、羽毛蛋白和脂肪的生长速率差异显著(P<0.05),而胴体蛋白和脂肪的生长速率差异不显著(P>0.05)。2)在0~3、4~6和7~8周... 相似文献
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ICP-OES法同时测定果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡含量 总被引：2，自引：0，他引：2
果蔬样品经混酸消化后,控制一定的酸度,定容后应用等离子体发射光谱法(ICP-OES)对果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡六种有害重金属进行测定,研究了分析测定条件,方法简单快速。测定结果表明,五种元素的加标平均回收率在91.0%~107%之间。其RSD均小于3.5%。按该方法进行处理及测定铅、砷、镉、铬、铜、锡,在选择的测定条件下最低检出限分别为0.0006 mg/kg、0.0003 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.00005 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.0006 mg/kg。 相似文献
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Characterisation of Neonicotinoid and Pymetrozine Resistance in Strains of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from China 
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下载免费PDF全文 RAO Qiong XU Yong-hua LUO Chen ZHANG Hong-yu Christopher M Jones Greg J Devine KevinGorman Ian Denholm 《农业科学学报》2012,11(2):321-326
Four strains of the Q biotype and one of the B biotype of the whitefly Bemisia tabaci collected from China were characterised for resistance to four neonicotinoid insecticides and pymetrozine. Q biotype strains showed moderate to strong resistance to imidacloprid, thiamethoxam and acetamiprid, but little or no cross-resistance to dinotefuron. Resistance to neonicotinoids was consistently associated with resistance to pymetrozine, despite the latter having a distinct (though unresolved) mode of action. The single B biotype strain proved largely susceptible to all the insecticides investigated. Resistance in the Q biotype strains was associated with over-expression of a cytochrome P450 monooxygenase gene, CYP6CM1, whose substrate specificity presumably accounts for the observed cross-resistance profiles. 相似文献
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据作者近年来实地调查,采集标本,归纳了新疆地区的野生观赏植物,观赏价值较高者共有54科117属392种。 相似文献
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[目的]研究烘烤对不同部位烟叶微生物种群的影响。[方法]采用不同的培养基分离鉴定烘烤过程中烟叶上的微生物,调查在烟叶烘烤过程中微生物种群的变化。[结果]在新鲜烟叶上,微生物种类是下部叶比中部叶多,上部叶上的微生物种类相对最少。烟叶经过烘烤后,不同叶位烟叶上的微生物种类明显少于新鲜烟叶。烟叶在烘烤进程中,细菌种类一直在减少;放线菌在定色期有所增加;中、下部烟叶的霉菌在烘烤过程中减少,而在上部烟叶霉菌在变黄、定色期增加,然后在干筋期减少。[结论]该研究可为预防烟叶在烘烤过程中腐烂和提高烟叶品质提供科学依据。 相似文献
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