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[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。 相似文献
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为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础. 相似文献
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为构建小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体,并检测其对酵母细胞的自激活作用.利用RT-PCR扩增Ta Trx-h基因的ORF区域,并与pGBKT7载体连接构建诱饵载体pGBKT7-Trx-h,利用PEG/LiAC法转化酵母AH109后,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无自激活作用.结果表明,含pGBKT7-Trx-h质粒的酵母在SD/-Trp-Leu培养基上能正常生长,说明诱饵载体表达产物对酵母细胞无毒性作用;在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上不能生长,说明诱饵质粒无自主激活报告基因的作用.因此,可以利用该诱饵载体通过酵母双杂交方法筛选与Trx-h蛋白相互作用的蛋白. 相似文献
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[目的]构建诱饵载体pGBKT7-Lescpth5,并检测其转录自激活活性及对酵母细胞的毒性。[方法]采用PCR技术扩增Lescpth5基因,连接到诱饵载体pGBKT7上,转化重组载体于酵母感受态细胞AH109中,在营养缺陷型培养基上进行自激活检测和毒性检测。[结果]酶切和测序鉴定结果显示诱饵载体pGBKT7-Lescpth5构建成功,读码框正确。自激活检测结果和毒性检测结果显示诱饵载体对酵母菌株AH109没有转录激活活性,对酵母菌也无毒害作用。[结论]成功构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步的cD-NA文库筛选奠定基础。 相似文献
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采用巢式PCR获得甘蓝SCR的成熟肽编码区,利用同源重组技术首次将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-SCR,结果表明:通过巢式PCR获得了正确的甘蓝SCR成熟肽编码区,并成功构建到pGBKT7诱饵载体中,且转化有诱饵载体的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,而在SD/-His-Trp和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA营养缺陷平板上皆不能生长,说明对报告基因无自激活作用;且毒性实验也表明,SCR蛋白对酵母没有毒害作用. 相似文献
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[目的]构建含羊布鲁氏菌16M Omp25基因的酵母双杂交诱饵质粒,检测诱饵质粒表达产物对cdc25H酵母细胞有无毒性作用以及对报告基因有无激活作用。[方法]聚合酶链反应(PCR)扩增布鲁氏菌Omp25基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos上,构建诱饵重组质粒pSos-Omp25,经测序正确后,将其将转化到酵母菌cdc25H感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。[结果]序列测定证明重组诱饵质粒pSos-Omp25构建成功;重组质粒表达产物对cdc25H酵母细胞无毒性,对报告基因无激活作用。[结论]利用SOS恢复系统(SRS)成功构建了羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白酵母双杂交诱饵质粒,为筛选与羊布鲁氏菌16M Omp25蛋白相互作用的蛋白创造了条件。 相似文献
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[目的]寻找水稻LRR型蛋白受体激酶(Leucine rich repeat receptor protein kinase) OsRPK1胞外结构域的互作蛋白.[方法]以日本晴水稻为研究材料,以水稻根部cDNA为模板通过PCR扩增方法得到OsRPK1胞外结构域基因编码片段OsRPK1-OD(969 bp).将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建重组诱饵载体pGBKT7-OsRPK1-OD.[结果]对pGBKT7-OsRPK1-OD进行毒性检测和转录自激活鉴定,酵母生长结果发现,含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold细胞,在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal营养缺陷型固体培养基上生长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-gal/AbA固体培养基上生长受到抑制;在SD/-Trp生长出含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold酵母菌落大小与转化了空载的酵母菌落大小一致,显示插入的OsRPK1-OD对酵母生长无毒性作用.[结论]OsRPK1-OD无法参与激活转录酵母中报告基因HIS3,ADE2,MEL1和AUR1-C,该片段可以作为诱饵基因筛查水稻cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质. 相似文献
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筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达. 相似文献
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目的：用人蛋白激酶CK2α’(hCK2α’)cDNA片段构建酵母双杂交体系中“诱饵”载体。方法；通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pThCKA’获得人CK2α’亚基编码区cDNA，将PstⅠ／NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7，转化感受态细胞DH5α获得转化子．琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子，将阳性克隆进行限制性内切酶酶切与DNA测序的方法鉴定。将DNA测序验证的pGBKT7-hCK2α’转染感受态酵母株AH109．Westernblot签定hCK2α’蛋白表达．检测表达产物对报道基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性。结果：限制性酶切结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论值推测值相符。重组质粒pGBKT7-hCK2α’转染的酵母株AH109中能够表达hCK2α’蛋白，pGBKT7-hCK2α’无自主激活报道基因的能力及对酵母的生长无毒性。结论：pGBKT7-hCK2α’酵母双杂“诱饵”载体构建获得成功，可应用于酵母双杂交体系。 相似文献
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【目的】构建幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)P58亚单位酵母双杂交诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与空泡毒素P58亚单位相互作用的蛋白奠定基础。【方法】采用PCR方法,从幽门螺杆菌s1/m1型标准毒株NCT11637基因组中扩增空泡毒素P58亚单位,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后克隆入经同样酶切处理的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,构建pGBKT7-VacA P58重组质粒,并将其转化E.coliDH5α,提取质粒经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切、测序鉴定正确后,转化入宿主酵母菌AH109,色氨酸(Trp)缺陷压力筛选,对阳性转化酵母菌扩大培养,提取总蛋白进行Western-blot鉴定,同时检测重组蛋白有无毒性、渗漏和自激活活性。【结果】成功扩增长度为1202bp的空泡毒素P58片段,重组质粒pGBKT7-VacA P58经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切可得到1202bp大小的片段,测序结果显示扩增产物序列与参考序列完全匹配。重组质粒pGBKT7-VacA P58成功地转化至酵母细胞AH109中。表达的诱饵蛋白无毒性、无渗漏及无自激活活性,Western-blot分析证实酵母菌AH109细胞正确表达了重组蛋白。【结论】成功构建了幽门螺杆菌空泡毒素P58亚单位酵母诱饵表达载体,其可在酵母菌系统中成功表达,且表达产物正确。 相似文献
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新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu。 相似文献
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《山西农业大学学报(自然科学版)》2018,(12)
[目的]生物信息学分析葡萄DFR蛋白的功能结构域和蛋白互作预测,构建DFR酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。[方法]利用NCBI中的CDD分析DFR蛋白保守区域,STRING在线软件对DFR蛋白互作情况进行预测,采用PCR技术扩增出葡萄DFR基因,克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,PEG/LiAc法将阳性质粒pGBKT7-DFR转化至酵母AH109中,通过缺陷型培养基培养进行自激活检测。[结果]DFR蛋白保守区域有NADP结合位点,预测到DFR蛋白与MybPA1蛋白有互作关系。成功构建了诱饵载体pGBKT7-DFR,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。[结论]本研究通过生物信息学分析得出,酵母诱饵蛋白表达载体pGBKT7-DFR,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与DFR相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。 相似文献
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为构建新城疫病毒(NDV)V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒,用RNA试剂盒提取NDV F48E9株的RNA,通过反转录试剂盒将抽提的RNA反转录,以反转录合成的eDNA为模板,通过PCR扩增,获得V蛋白C端基因(VCTD).通过酶切连接的方法将V蛋白C端基因克隆至pGBKT7载体上,命名为pGBKT7-VCTD.将pGBKT7-VCTD转化酵母Y2H Gold酵母感受态细胞,转化产物涂布营养缺陷型平板,观察平板上菌落生长情况,判定诱饵质粒有无自激活能力:同时挑取平板上的生长的菌落接种液体培养基培养,绘制生长曲线,判定pGBKT7-VCTD诱饵质粒有无毒性.酶切和测序结果表明,成功构建pGBKT7-VCTD诱饵质粒,且该诱饵质粒在酵母细胞中无毒性和自激活能力.本研究成功构建了pGBKT7-VCTD诱饵质粒,为筛选NDVV蛋白C端纳米抗体奠定基础. 相似文献
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T1083替换融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母的自激活试验（摘要）（英文） 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]研究T1083替换融合质粒载体pGBKT7-Ts转入酵母的自激活实验,探讨其表达产物是否可作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[方法]将T1083替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母后,进行自激活和蛋白表达毒性检测试验。pGBKT7-TS对报告基因自主激活的检测。将pGBKT7-TS质粒转染S.cerevisiae strainAH109和S.cerevisiaeY187菌株,同时分别转入pGBKT7作为对照,在SD-Trp平板上挑取转化菌落,悬于适量无菌水中,再分别接种于SD-Trp ＋X-α-gal、SD-Trp-His ＋X-α-gal、SD-Trp-Ade ＋X-α-gal和SD-Trp-Ade-His ＋X-α-gal平板。30℃培养2 ～3 d,观察各平板菌落颜色。确定含有pGBKT7-TS质粒的AH109和Y187酵母细胞内HIS、ADE、Mel1、LacZ报告基因的表达情况。pGBKT7-TS对酵母AH109和Y187的毒性检测、挑取大于2 mm的pGBKT7-TS转化的AH109克隆和pGBKT7-TS转化的Y187克隆各1个,分别接种于50 ml SD/-Trp＋Kan（20μg/ml）培养基中,30℃、250 r/min培养16 h,检测OD600,若OD600〈0.8,则DNA-BD可能有毒性;若OD600≥0.8,说明DNA-BD无毒性。[结果]转化pGBKT7-TS的酵母菌AH109在SD-Trp ＋X-α-gal平板和SD-Trp-His ＋X-α-gal平板上均可长出菌落,但在SD-Trp-Ade ＋X-α-gal平板和SD-Trp-Ade-His＋X-α-gal平板上均无菌落生长,表明转入pGBKT7-TS后His报告基因有泄漏表达,但不能激活ADE和MELI报告基因。毒性检测试验中,重复2次,其OD600均大于0.8,说明DNA-BD融合蛋白对酵母AH109和Y187的生长无毒性,可以作为诱饵进行酵母双杂交筛选。[结论]为进一步研究NtKRP尾部T1083替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了试验基础。 相似文献
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应用酵母双杂交系统筛选GbVWR互作蛋白 总被引：1，自引：0，他引：1
前期研究表明海岛棉(Gossypium barbadense)GbVWR(Verticillium wilt resistance)基因参与了棉花抗黄萎病反应,但其抗病机制尚不清楚。本试验利用酵母双杂交系统筛选GbVWR互作蛋白,并通过对互作关系的分析初步探讨其介导的棉花抗病机制。结果表明:本研究成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-GbVWR,并利用PEG/LiAc法将其转化至酵母菌株Y2HGold感受态细胞中,结果显示重组质粒无自激活活性及毒性;用携带诱饵载体pGBKT7-GbVWR的酵母菌株与黄萎病诱导的海岛棉Pima90-53酵母双杂交cDNA文库进行杂交,通过PCR、测序和数据库比对分析插入的基因片段,共筛选到24个与GbVWR潜在互作的蛋白,为进一步探明GbVWR的抗病功能提供了理论依据。 相似文献
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《山西农业大学学报(自然科学版)》2016,(3)
玉米中ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力,然而截至目前对其潜在的分子机制却知之甚少。为构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其在宿主酵母菌MaV203中的自激活活性和毒性,利用gateway技术,以实验室保存的重组质粒pMD19T-ZmMPK5为模板,扩增得到带有attB位点的ZmMPK5基因的ORF片段,通过BP重组反应和LR重组反应,最终将该片段构建到诱饵表达空载体pDEST32上,PCR及测序鉴定结果表明,成功构建了阅读框方向和序列均正确的重组诱饵载体pDEST32-ZmMPK5。用PEG/LiAc法将重组诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5转化酵母菌株MaV203感受态细胞,通过缺陷型平板表型分析以及X-gal分析实验检测诱饵载体表达的蛋白对宿主细胞是否具有毒性和自激活作用。最终结果表明构建的诱饵载体对宿主酵母菌MaV203既无毒性也无自激活活性,可用于后续研究,为进一步利用酵母双杂交方法从玉米cDNA文库中筛选与ZmMPK5相互作用蛋白奠定了基础。 相似文献
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利用PCR方法扩增稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1,并在其上下游分别引入酶切位点EcoRI和XhoI,经双酶切后与诱饵质粒载体pLexA连接构建重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,将该重组诱饵质粒转入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中进行β-半乳糖苷酶整板分析检测自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pLexA-PEMG1,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为筛选番茄cDNA文库获得诱饵蛋白PemG1的相互作用蛋白奠定了基础。 相似文献