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为给奶牛营养代谢病等相关研究提供种子细胞,本试验从犊牛肾周脂肪组织中分离出脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs),采用组织剪碎法结合0.25%Ⅰ型胶原酶消化法消化、收集原代犊牛ADSCs,通过细胞形态学观察,使用免疫荧光染色法检测第5代ADSCs表面特异性蛋白,并使用CCK-8法测定第5、10代细胞生长曲线,观察第10代细胞的成脂、成骨分化能力。结果显示,分离出的犊牛ADSCs接种4 d后细胞呈成纤维细胞样生长;免疫荧光染色结果显示,分离的细胞Vimentin、CD34、CD44、CD90呈阳性,CD31、CD45呈阴性;该细胞在适当的诱导条件下可以定向分化为脂肪细胞和成骨细胞。本试验分离培养的细胞是犊牛脂肪干细胞,具有成脂、成骨分化能力。 相似文献
2.
取蒙古马背臀部皮下脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等步骤分离培养脂肪组织来源的间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs),经过原代培养和传代培养,分别加入成脂诱导剂和成骨诱导剂培养,采用倒置显微镜观察诱导后的细胞形态变化,并通过油红O染色和茜... 相似文献
3.
[目的]建立奶牛脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)体外分离培养体系,并进行增殖能力检测、分化能力鉴定及生物学特性研究,为推广AD-MSCs在畜牧生产及其疾病治疗等方面的应用提供理论依据.[方法]通过I型胶原酶消化法分离奶牛AD-MSCs并进行代传培养,绘制P3、P6和P9代奶牛AD-MSCs的生长曲线及测定其群体倍增时间,分别采用流式细胞术及RT-PCR检测细胞表面标志物;使用干细胞成骨/成脂诱导分化完全培养基进行奶牛AD-MSCs成骨成脂诱导分化,经茜素红和油红O染色后鉴定其成骨成脂分化能力;并检测冻存奶牛AD-MSCs复苏后的存活率.[结果]分离及传代培养获得的奶牛AD-MSCs在体外培养条件下呈长梭形,折光性强,生长状态良好,其生长曲线呈典型的S形,符合Logistic生长规律.奶牛AD-MSCs高表达MSCs表面标志物CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达白细胞表面标志物CD45;分别使用干细胞成骨/成脂诱导分化完全培养基诱导的奶牛AD-MSCs经茜素红和油红O染色后,显微镜下可观察到大量的钙结节和红色脂肪滴.冻存6个月后进行细胞复苏,奶牛AD-MSCs的存活率高达96%;复苏奶牛AD-MSCs培养4 h内贴壁,呈典型的长梭形,生长状态良好,培养72 h细胞融合达80%~90%.[结论]通过I型胶原酶消化法从奶牛腹部脂肪组织分离获得的奶牛AD-MSCs具有良好的体外增殖能力及多向分化潜能,为畜牧生产研究及奶牛疾病治疗提供了一种良好的种子细胞来源. 相似文献
4.
动物干细胞作为重要遗传种质资源和再生医学的可行性资源，拥有广阔研究和应用前景。对荷斯坦牛脐带细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）进行分离、鉴定，并对其多向分化潜能等生物学特性进行研究。取3月龄健康荷斯坦牛胎牛脐带，采用Ⅳ型胶原酶分离细胞进行体外培养，获得的细胞贴壁后呈长梭形，生长曲线呈典型的“S”形，群体倍增时间随着代次的升高逐渐下降。免疫荧光和RT-PCR的检测结果都表明，分离的细胞中CD29、CD73、CD90、CD166均阳性表达，而CD45不表达。成脂肪诱导后，可见被油红染色液染色的脂滴，成脂肪关键基因LPL和PPAR-γ都阳性表达；成骨诱导分化后，可见被茜素红染色的钙结节，其表达成骨关键基因骨桥蛋白OPN和Ⅰ型胶原蛋白基因COL-Ⅰ；成软骨诱导分化后，可见被阿利新蓝染色的软骨组织，表达成软骨细胞关键基因转录因子基因SOX9和ACAN。成功从3月胚龄的荷斯坦牛脐带中分离出其具有良好的增殖活力及成脂肪、骨和成软骨能力的间充质干细胞，可为动物种质资源保存和再生医学提供依据和潜在可利用细胞资源。 相似文献
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【目的】建立鸡脂肪源间充质干细胞的分离与鉴定方法.【方法】用I型胶原酶消化法分离天露黄鸡脂肪间充质干细胞(AMSCs),CCK-8检测细胞生长活力,RT-PCR鉴定其特异性标记物,化学法对其进行成脂和成骨分化诱导.【结果和结论】原代及传代的细胞呈成纤维细胞样形态,并能传代至10代,其活力无明显变化;细胞生长曲线呈S型;RT-PCR检测显示AMSCs的特异性标志物CD71、CD44和CD29表达呈阳性,而属于造血干细胞的特异性标志物CD34和CD45呈阴性;AMSCs通过不同诱导液被成功诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,在成脂分化过程中有脂滴形成,油红O染色呈阳性,过氧化物酶体增殖物激活受体基因γ(PPARγ)和脂肪酸基因(FAS)的mRNA表达量升高;在成骨分化过程中有钙结节形成,茜素红染色呈阳性,碱性磷酸酶(ALP)活性检测对照组与诱导组比较差异显著(P﹤0.05),ALP基因和骨形态发生蛋白基因(BMP2)的mRNA表达量升高.研究表明,鸡AMSCs具有分化为多种细胞的潜能. 相似文献
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为了探讨HH信号通路在脂肪细胞分化过程中的作用机制,以猪脂肪间充质干细胞(ADSCs)为材料,经成脂诱导后,利用油红O染色观察脂肪细胞的形态变化,并检测诱导分化不同时期HH信号通路关键基因Smo、Ptc1、Gli1、Gli2以及成脂关键转录因子C/EBPα、PPARγ的表达情况。结果显示,在ADSCs细胞成脂分化过程中,脂肪细胞的数量逐渐增加,脂滴变大;Smo、Gli1、Gli2基因从第4天开始随诱导天数的增加表达量逐渐降低,而Ptc1的变化趋势与之相反;且C/EBPα、PPARγ的表达从第4天开始逐渐增加。结果表明,ADSCs细胞成脂诱导第4天HH信号通路的活性被全面启动,且随诱导天数的增加其活性逐渐降低。 相似文献
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8.
通过多重酶混合消化法和胰酶消化筛选法体外分离、纯化及培养绵羊脐带间充质干细胞(MSCs),并观察其生物学特性,以此建立绵羊脐带间充质干细胞的分离培养流程.试验采集健康的哈萨克羔羊脐带组织,剔除血管后剪碎,添加复合消化酶消化24 h得到细胞,胰酶消化法筛选除杂并观察细胞形态,绘制第1代、第5代及第10代细胞生长曲线;取第10代细胞检测其体外诱导成骨细胞能力和诱导成脂细胞能力,cAKP染色检测其分化状态.结果表明,获得的细胞经传代培养达10代后无明显的形态和增殖能力改变;体外诱导成骨细胞和成脂细胞试验证明其具有被诱导分化成骨细胞和脂肪的能力,cAKP染色证明其处于未分化状态.试验获得的绵羊脐带间充质干细胞能在体外培养、扩增并且具有和骨髓间充质干细胞类似的生物学特征. 相似文献
9.
为建立梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养方法及对梅山猪BMSC的生物学特性进行分析,本研究采用全骨髓法分离培养并传代梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以计数法检测细胞增殖状况,流式细胞术检测细胞周期,细胞压片进行染色体分析,免疫细胞化学和RT-PCR法检测细胞表面标志和转录因子的表达情况,并检测成骨和成脂分化能力.结果显示:梅山猪BMSC体外生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,具有稳定分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志基因及Fou5F1、Sox2、Nanog等转录因子基因表达呈阳性,CD45、Lin28表达呈阴性;在特定诱导液作用下,BMSC可分化为成骨样细胞及成脂肪样细胞.采用全骨髓法成功分离培养出大量纯度较高的梅山猪BMSC,其生长状态良好,可作为后续BMSC相关研究的种子细胞. 相似文献
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《中国农业科学》2020,(8)
【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈"S"型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异(P0.01)。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点(P0.01);CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著(P0.01)。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。 相似文献
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猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。 相似文献
12.
DU Min-qing HUANG Yue-qin LU Nai-Sheng SHU Gang ZHU Xiao-tong WANG Li-na GAO Ping XI Qian-yun ZHANG Yong-liang WANG Song-bo JIANG Qing-yan 《农业科学学报》2014,13(4):837-848
Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） could differentiate into various cell types including adipocytes and myocytes, which had important scientific significance not only in the field of tissue regeneration, but also in the field of agricultural science. In an attempt to exhibit the characterization and differentiation into adipocytes and myocytes of porcine BMSCs, we isolated and purified porcine BMSCs by red blood cell lysis method and percoll gradient centrifugation. The purified cells presented a stretched fibroblast-like phenotype when adhered to the culture plate. The results of flow cytometry analysis and immunofluorescence staining demonstrated that the isolated cells were positive for mesenchymal surface markers CD29, CD44 and negative for hematopoietic markers CD45 and the adhesion molecules CD31. Cells were induced to differentiate into adipocytes with adipogenic medium containing insulin, dexamethasone, oleate and octanoate. Oil Red O staining demonstrated that the porcine BMSCs successfully differentiated to adipocytes. Moreover, the findings of real-time PCR and Western blotting indicated that the induced cells expressed adipogenic marker genes （PPAR-y, C/EBP-c~, perilipin, aP2） mRNA or proteins （PPAR-3,, perilipin, aP2）. On the other hand, porcine BMSCs were induced into myoctyes with myogenic medium supplemented with 5-azacytidine, basic fibroblast growth factor, chick embryo extract and horse serum. Morphological observation by hochest 33342 staining showed that the induced cells presented as multi-nucleus muscular tube structure. And myogenic marker genes （Myf5, desmin） mRNA or proteins （MyfS, MyoD, myogenin, desmin） were found in the induced cells. In addition, the results of immunofluorescence staining revealed that myogenic marker （Myf5, MyoD, myogenin, desmin, S-MyHC） proteins was positive in the induced cells. Above all, these results suggested that the isolated porcine BMSCs were not only consistent with the characterization of mesenchymal stem cells, but also exhibited the multipotential capacity to form adipocytes and myocytes, which provided the basis to investigate the regulation mechanism involved in the selective differentiation of porcine BMSCs. 相似文献
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采用大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)进行分离、传代培养,研究大鼠心肌细胞条件培养基对兔ESC分离培养效果的影响。结果显示,用SD大鼠心肌细胞条件培养基培养的兔ESC集落呈岛屿状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;常规冻存后再传代的兔ESC集落具有较为一致的生长特征,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;传至第5代的兔ESC集落核型正常率>75％。表明SD大鼠心肌细胞条件培养基可用于兔胚胎干细胞分离培养。 相似文献
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用剪切及剪切加胰蛋白酶法消化兔泪腺组织。获取兔泪腺上皮细胞，设计相应的培养基，进行组织块原代培养或混合消化原代培养，用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果表明。组织块在体外培养10d，可见上皮样细胞从植块边缘长出，2周后泪腺上皮细胞在培养瓶底部铺成单层，经传代3次，角蛋白染色阳性细胞纯度达90％以上；用混合消化法接种的细胞生长相对较慢。结果提示：用剪切组织块进行培养的方法简便易行，易获得符合要求的兔泪腺上皮细胞。 相似文献
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【目的】建立马脐带间充质干细胞（UC-MSCs）体外分离培养体系,研究其增殖能力、分化能力和生物学特性,为推广UC-MSCs在赛马运动损伤治疗方面的应用提供理论依据。【方法】采用I型胶原酶消化法从脐带组织分离马UC-MSCs,通过绘制生长曲线及计算群体倍增时间检测其体外增殖能力,结合流式细胞仪检测和RT-PCR扩增鉴定表面标志物（CD29、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105）,并通过体外成脂成骨诱导分化检测其分化潜能。【结果】分离获得的原代马UC-MSCs为折光性强的圆形悬浮细胞,培养10 d后细胞融合达90%,且传代后细胞增殖速度明显提高,传代至P3代,细胞呈旋涡状生长,形态为均一的长梭形,生长趋势符合Logistic生长曲线规律,呈典型的S形。流式细胞仪检测结果显示,马UC-MSCs高表达CD29、CD44和CD90,表达率分别为98.45%、97.08%和96.56%,呈强阳性,但不表达CD45;RT-PCR扩增结果表明,马UC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSCs表面标志物基因,但不表达CD45基因。以胰岛素、IBMX、罗格列酮和地塞米松为主要试剂进行马UC-MSCs体外成脂诱导,诱导第10 d发现细胞内有小脂滴形成,至诱导第18 d有大量脂滴形成;选用抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松为主要试剂进行体外成骨诱导,至诱导第7 d可观察到钙结节形成。【结论】采用I型胶原酶消化法分离获得的马UC-MSCs纯度高,且具有良好的体外增殖能力和多向分化潜能;掌握好马UC-MSCs的有效冻存方式,可为治疗赛马运动损伤提供优质的种子细胞。 相似文献
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八眉猪肌内前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化 总被引：1，自引：0，他引：1
以域型胶原酶消化5日龄八眉猪仔猪背最长肌组织,分离肌内前体脂肪细胞,经差速贴壁法纯化后接种培养,以RT-PCR 和油红O 染色法对分化前后的细胞进行鉴定,通过观察细胞形态变化,细胞贴壁率测定,及用MTT法检测增殖活性,油红O染色提取法检测成脂诱导分化过程中细胞脂肪含量的变化,分析前体脂肪细胞生长特性和分化能力。结果表明,分离的八眉猪肌内前体脂肪细胞呈梭状、形似成纤维细胞,贴壁性能好,贴壁率最高可达90%;细胞生长良好增殖曲线呈“S”型,符合正常的细胞生长规律;肌内前体脂肪细胞体外自发分化能力弱,但经成脂诱导,可以分化为具有脂肪细胞典型特征的成熟脂肪细胞,分化水平以时间依赖方式显著提高。 相似文献
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研究采用红细胞裂解液法从兔骨髓中分离BMSCs,相差显微镜观察其形态,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)筛选基础培养液和血清浓度,绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学鉴定表面抗原。分离的细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征;在实验范围内DMEM/F12+20%FBS是体外培养兔BMSCs的最佳体系;细胞周期结果显示,BMSCs平均82%处于G0/G1期,18%处于S+G2期;免疫细胞化学结果显示所分离的BMSCsCD90、CD44阳性表达,CD34阴性表达。本研究结果表明,通过红细胞裂解液法分离的兔BMSCs,其具有体外增殖和多向分化的潜能,可以作为组织工程的种子细胞。 相似文献
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用山羊组织块和0.25%的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞,对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,则根据两者贴壁紧实程度不同,用0.05%的胰酶-EDTA进行不同时间的消化,将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后,进行冷冻解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明,在体外培养至20~30代成纤维细胞的细胞形态(为梭形细胞,高度汇合后呈火焰状)、细胞周期以及核型均为正常,符合体细胞克隆转基因的基本要求。 相似文献
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对分离获得的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行低温冻存研究。用红细胞裂解法体外分离培养BMSCs,采用SABC法进行鉴定;冻存后复苏,台盼蓝染色检测细胞复苏率,观察冻存时间(15d,30d,90d)对各代(P1,P3,P9代)细胞复苏效果的影响;向脂肪细胞诱导分化验证其干细胞多潜能分化特性。结果表明:BMSCs呈长梭形,聚集成旋涡状均匀生长,SABC法鉴定其为BMSCs;冻存前后P1、P3代细胞活力好,增殖速度快;P9代细胞增殖缓慢;冻存时间对P1、P3代细胞复苏率的影响不显著(P0.05),复苏率较高;但是P9代细胞复苏率极低,并且随着冻存时间的延长,细胞复苏率逐渐降低;冻存复苏的细胞向脂肪细胞诱导分化,油红浸染红色。可见:红细胞裂解液法分离获得的BMSCs生长生物学性状稳定;P3代以前冻存增殖和分化特性不受影响,可作为种子细胞用于后续研究。 相似文献