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1.
褐飞虱(Nilaparvata lugens)是中国水稻(Oryza sativa)生产中对水稻危害极为严重的农业害虫之一。随着微生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringsis,Bt)的使用及转Bt杀虫基因作物的推广,对Bt不敏感的褐飞虱的防治将成为难点。当前研究表明Cry毒素与靶标昆虫中肠膜结合氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)的结合是Bt Cry毒素毒理机制中的重要步骤。本研究对褐飞虱转录组数据中获得的一个褐飞虱中肠apn基因进行全长克隆,构建Bacmid-bphAPN重组杆状病毒载体,并在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞(Sf9)中表达。经Western blot、蛋白质谱及免疫荧光定位检测证实bphAPN蛋白成功表达。细胞毒性实验结果显示表达了褐飞虱中肠APN的Sf9细胞对Cry1Ac活化蛋白不敏感。褐飞虱中肠APN的体外真核表达有助于褐飞虱中肠APN的特征分析,为开发对褐飞虱有毒性作用的新型Cry毒素提供了资料基础。 相似文献
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苏云金杆菌Cry2Ab可溶蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
苏云金杆菌Cry2Ab蛋白是一类对鳞翅目昆虫有特异性毒性作用的毒素蛋白,已广泛应用于针对鳞翅目害虫的防治之中。依据苏云金杆菌cry2Ab基因序列设计一对全长引物,从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)WB9菌株总DNA中克隆出cry2Ab基因全序列,构建Cry2Ab-PK表达载体,将获得的Cry2Ab-PK阳性克隆进行原核诱导表达,获得约90kD的Cry2Ab-GST融合蛋白,经批量纯化并切除GST标签后获得可溶Cry2Ab蛋白,约65kD。利用纯化Cry2Ab可溶蛋白免疫新西兰雄性大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备Cry2Ab兔源多克隆抗血清,通过间接ELISA法测定Cry2Ab抗血清效价超过1:150000。Western blot测定结果表明,制备的Cry2Ab兔源抗血清能特异性识别Cry2Aa及Cry2Ab抗原蛋白,不能识别Cry1Ab及Cry3Aa抗原蛋白。研究结果对深入研究Cry2A毒素蛋白作用机理及毒素与受体间互作关系提供了技术支持。 相似文献
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由于Bt Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac晶体蛋白之间具有很高的同源性(82%~90%),采用常规的单抗制备方法很难制取特异性强的Bt Cry1Ab单抗,为了制备抗Bt Cry1Ab蛋白的特异性单克隆抗体(MAB),本研究从NCBI获得了Bt Cry1Ab蛋白的氨基酸序列,根据ANTHEPORT和DNAStar软件对其抗原性、亲水性和表位性分析结果选定BtCry1Ab特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞22株。通过ELISA试验从中筛选出与Bt Cry1Ab天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株(3A10)。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1型;轻链属κ型;杂交瘤细胞株染色体数目为89~108条;用其制作的腹水对Bt Cry1Ab合成肽的反应效价为1∶1×107;对Bt Cry1Ab天然蛋白的反应效价为1∶1×104;纯化后的抗体对Bt Cry1Ab合成肽的效价为1∶1×108;对Bt Cry1Ab天然蛋白的效价为1∶2×104。抗体的相对亲和力为0.5μg/mL,对Bt Cry1Ab蛋白的最低可检测值为10ng/mL。ELISA结果显示,3A10杂交瘤细胞株所分泌的MAB能特异性识别合成肽和Bt Cry1Ab蛋白,而对同源的Cry1Ac和Cry1Aa蛋白无交叉反应;本研究所制备的Bt Cry1Ab单克隆抗体能够对常规棉和抗虫棉(Gossypium hirsutumL.)进行有效的区分,并且能特异性的识别其中的Bt Cry1Ab蛋白。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry3A结构域编码区的融合 总被引：1，自引：0，他引：1
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)毒素蛋白由3个不连续的结构域（domains)组成，其中结构域I为膜跨越区，与膜孔道形成有关，结构域Ⅱ，Ⅲ与受体结合有关。利用基因重组技术以鳞翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry1Aa与专一性有关的结构域编码区与对鞘翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry3A编码基因融合，构建成融合表达载体，为进一步构建Bt工程菌和Bt转基因植物奠定基础。 相似文献
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对Bt抗性和敏感亚洲玉米螟解毒酶和中肠蛋白酶的比较 总被引：2，自引：0，他引：2
比较了人工汰选的对Cry1Ab杀虫蛋白产生抗性的亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis(Guenée))种群和敏感种群幼虫解毒酶和中肠蛋白酶的变化。结果表明:抗、感种群的乙酰胆碱酯酶、中肠总蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活力差异不显著,而抗性种群的α-乙酰萘酯酶和类胰蛋白酶显著高于敏感种群。对类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和类弹性蛋白酶的活力杂交分析结果表明,抗性种群的类胰蛋白酶酶谱强于敏感种群,但抗、感种群中肠液在体外对Cry1Ab原毒素的酶解过程并不存在差异。推断强碱性类胰蛋白酶可能与亚洲玉米螟对Bt抗性产生机理有关。 相似文献
6.
通过免疫新西兰大白兔,制备并纯化Bt(Cry1F)毒素多克隆抗体,建立针对Cry1F毒素检测的免疫学分析方法,用于室内分析毒素在农产品和土壤中的残留情况。采用皮下注射法,经4次级联免疫,获得免疫血清效价为1:2 500 000,经柱纯化后,测得抗体浓度为4.70 mg/m L;并以其建立的针对Cry1F毒素的间接非竞争时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA),测得线性检测范围在0.04~2 000 ng/m L,最低检测灵敏度为0.03 ng/m L,对5种供试毒素类似物(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry2A)均具一定交叉识别能力。分别以稻米和黄土为基质,进行添加回收试验,测得批内、批间的稳定性和重复性均达到室内仪器检测要求。 相似文献
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以转cry1Ab基因高粱为材料提取Cry1Ab蛋白，测定了Cry1Ab蛋白在6种土壤中的吸附与解吸，分析了Cry1Ab蛋白溶液浓度、土壤理化性质对Cry1Ab蛋白吸附与解吸的影响。结果表明，不同类型的土壤对Cry1Ab的吸附与解吸存在明显的差异，吸附量表现为红泥土〉灰化土〉青紫泥田〉黄筋泥〉黄松田〉红砂土，解吸量表现为灰化土〉青紫泥田〉红砂土〉黄筋泥〉红泥土〉黄松田；Cry1Ab蛋白溶液的浓度与吸附量和解吸量呈显著正相关，相关系数分别为0．86和0．99；土壤有机质、pH值与土壤吸附Cry1Ab蛋白的能力呈显著正相关，相关系数分别为0．83和0．82；土壤全氮、有效磷的含量与土壤吸附Cry1Ab蛋白呈正相关，土壤全氮、有效磷和速效钾的含量与解吸均呈负相关。土壤吸附、解吸Cry1Ab蛋白是加入Cry1Ab蛋白溶液的浓度及不同土壤的理化性质共同作用的结果。 相似文献
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Cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白。第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3534bp,编码蛋白分子量为133kD,含1178个氨基酸,等电点为4.84。白此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向。本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用Bt Cry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解。 相似文献
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研究亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)对Cry1Ab产生抗性的分子机理,对今后制定和实施合理的抗性治理策略具有重要的意义。本研究通过PCR方法克隆和测序,鉴定了Cry1Ab敏感-抗性亚洲玉米螟幼虫中肠氨肽酶N(APN)基因家族的一个成员Ofapn3,其cDNA全序列长3591bp,开放阅读框包括3045bp,编码1014个氨基酸。预测蛋白质分子量为115.1kD,等电点(pI)为4.44。其推导的氨基酸序列中具有鳞翅目昆虫氨肽酶典型结构特征,即N-末端具有18个氨基酸的剪切信号肽,谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN,锌结合位点HEXXHX18E,C-末端具有22个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。系统分类归为第3支系。与欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的Onapn3(GenBank登录号:ABL01483)同源性为96.6%。与Cry1Ab敏感亚洲玉米螟cDNA相比,抗性品系的开放阅读框中有40个碱基发生了点突变,导致氨基酸序列中有10个氨基酸改变。其中Ser735在抗性品系中突变为Pro的现象在抗性棉铃虫APN3的氨基酸突变中也被检测到。鉴定的Cry1Ab敏感和抗... 相似文献
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苏云金芽胞杆菌WZ-9菌株对马铃薯瓢虫的毒力及其杀虫基因的研究 总被引：4，自引：0，他引：4
苏云金芽胞杆菌(Bacillus tbutingiensis)WZ-9是从土壤中分离的对马铃薯瓢虫(Henosepilachna vigintioctomaculata)的幼虫有特异杀虫活性的新菌株.实验对WZ-9菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等进行了研究.结果表明,WZ-9菌株可产生菱形伴胞晶体,SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130 Kd;液体培养的生长周期是24 h,随菌株的生长培养基Ph发生较大波动,在潜伏期和稳定期,Ph变化较小,在对数生长期Ph呈先迅速下降、再缓慢回升的变化趋势;生物活性测定表明,WZ-9菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72 h校正死亡率达100%,LC50为2.95×107细胞/Ml;基因型鉴定表明,WZ-9菌株含有cry7基因,利用PCR扩增方法获得了1条总长为3 781 bp基因序列,其中包含了1个3 414 bp开放读码框,其编码蛋白由1138个氨基酸残基组成,与Cry7Ab2具有99.65%序列同源性,存在4个氨基酸差异,亲缘关系最近,被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3(登录号为BI1015188). 相似文献
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宋萍 《农业生物技术学报》2008,16(3)
苏云金芽孢杆菌WZ-9是本室从河北省土壤中分离的对马铃薯瓢虫的幼虫有特异杀虫活性的新菌株，本文对该菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等方面进行了研究。结果表明该菌株可产生菱形伴孢晶体，SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130kDa，生长周期是24h，随菌株的生长培养基pH值发生变化；生物活性测定表明该菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72h校正死亡率达100%，LC50为2.95×107细胞/mL；基因型鉴定表明含有cry7基因，获得了一条总长为3781bp基因序列，其中包含了一个3414 bp的开放读码框，其编码的蛋白由1138个氨基酸残基组成，与Cry7Ab2具有99.65%的序列同源性，存在4个氨基酸差异，亲缘关系最近，该蛋白被Bt 杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3( 登录号为BI 1015188) 。 相似文献
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双Bt基因提高青花菜对菜粉蝶和小菜蛾抗性 总被引：4，自引：0，他引：4
以青花菜（Brassica oleracea L.ssp.italica）下胚轴为外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）晶体毒蛋白基因Cry1Ac和Cry1C分别导入青花菜栽培品种绿彗星中,各获得35株卡那霉素抗性植株。分别以Cry1Ac和Cry1C特异引物对转基因植株进行PCR扩增,结果得到27株Cry1Ac阳性植株和13株Cry1C阳性植株。以目的基因Cry1Ac和Cry1C为探针,进行Southernblot分析,证明多数植株目的基因已经整合到青花菜基因组中。对含有单拷贝目的基因植株自交纯合后通过有性杂交获得带有Cry1Ac和Cry1C双价的转基因青花菜。利用RT-PCR检测Bt基因在转基因植株中的表达情况,发现不同株系间在RNA水平上存在显著的表达差异,部分株系中双价Bt同时得到表达。ELISA检测转基因植株Bt毒蛋白含量为0.12～0.82μg/gFW。结合室内和田间饲虫试验,证明抗虫效果与Bt毒蛋白表达水平正相关。通过多世代选择,获得高抗菜粉蝶（Pieris rapae L.）和小菜蛾（Plutella xylostella L.）的纯合转基因青花菜材料。双价抗虫基因共同作用,提高了青花菜的抗虫性。 相似文献
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新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性 总被引：3，自引：0，他引：3
本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。 相似文献
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利用双向电泳分离棉铃虫中肠Cry1Ac受体蛋白,对于进一步明确棉铃虫受体的种类、发现新受体、寻找可能与抗性有关的受体非常重要。根据第一向等电聚焦的方式不同,可将双向电泳分为两种系统：ISO-DALT(isoelectric focus-dalton weight)和IPG-DALT（immobilized pH gradient-dalton weight）。确定最适合的双向电泳方法,可以为进一步研究受体蛋白奠定基础。本研究比较了ISO-DALT和IPG-DALT两种双向电泳系统结合western blotting技术分离棉铃虫中肠Cry1Ac受体蛋白的效果。结果表明,这两种系统都可以用于棉铃虫Cry1Ac受体的分离,ISO-DALT对受体分离效果比IPG-DALT更好,ISO-DALT比较经济但对后续的质谱工作不利,IPG-DALT较昂贵但有利于进行后续试验。 相似文献
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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫晶体蛋白Cry7Ba1需要在强碱性缓冲液中（pH12.5）才能溶解,而且只有溶解后才能对小菜蛾（Plutella xvlostella）表现出毒力,其LC50为1.33μg/mL。分别用Cry1Ac和Cry1C晶体蛋白的C-半段替换Cry7Ba1的C-半段,结果发现当Cry7Ba1的C-半段被替换后,重组晶体蛋白与Cry1Ac和Cry1C等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下（pH9.5）能有效溶解,而且重组晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性没有发生明显变化,其LC50分别为1.32和1.39μg/mL。结果还显示重组晶体蛋白不需要经过体外溶解就能对小菜蛾表现出杀虫活性。研究结果揭示Cry7Ba1晶体蛋白难溶的特性是由其C-半段结构决定的,通过改变其C-半段结构改善溶解性,为该晶体蛋白在害虫生物防治中的应用提供了可能。 相似文献
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转Bt基因抗虫水稻的成功研发,为有效控制鳞翅目害虫对水稻的危害提供了一条最为有效、经济的途径。稻田底栖动物群落是转Bt基因抗虫水稻的重要非靶标生物。为了解转Bt基因水稻对稻田底栖动物群落的安全性,以转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻‘华恢1号’(简写为HH1)为材料,以其非转基因亲本‘明恢63’(简写为MH63)为对照,以稻田底栖动物群落为指示生物,运用群落学方法,通过连续2年在江西南昌的大田试验,研究了转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻对稻田底栖动物群落的影响。结果显示:2012年在HH1与MH63的稻田中分别采集到底栖动物22种与25种,其中两生境中相同物种19种,两群落物种组成相似度为0.808 5,有7种优势种,优势种相似度为0.833 3。2013年在HH1与MH63稻田中分别采集到底栖动物26种与28种,两类稻田相同底栖动物22种,两群落物种组成相似度为0.814 8,有6种优势种,优势种相似度为1.000 0。2012年与2013年群落总体分析与时间动态分析均显示,两类稻田中底栖动物的物种丰富度、个体数量、多样性指数、均匀性指数及优势集中性指数变化趋势相似,且均无显著差异。结果表明:连续种植2年转Cry1Ab/Ac基因水稻HH1对南昌稻田底栖动物群落无明显的负作用。 相似文献
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苏云金芽胞杆菌cry1Ia基因的克隆、表达与活性研究 总被引：3，自引：0，他引：3
根据cry1Ia类基因的全长序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Btc008的总DNA为模板扩增出片段长为2.1kb的cry1Ia的全长基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-21b,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,诱导表达出81kD的蛋白。该蛋白由719个氨基酸组成,推导的分子量为81.2kD。该蛋白的氨基酸序列不同于已知的12种Cry1Ia蛋白,是一种新的Cry1Ia蛋白,该基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ia8。杀虫活性测定结果表明:Cry1Ia8对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50分别为0.268μg/g和2.227μg/mL,其杀虫效果与Cry1Ab和Cry1Ac相当。对大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)也有较好的活性,但对鞘翅目叶甲科害虫榆兰叶甲(Pyrrhalta aenescens)没有活性。该基因的获得将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源,为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了重要依据。 相似文献
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鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）有两类能与Cryl毒素结合的受体蛋白，一类是氨基肽酶N（APN），另一类是类钙粘蛋白（cadherin-like protein）。Gahan等（2001）报道了烟芽夜蛾中肠类钙粘蛋白基因失活导致了烟芽夜蛾（Heliothis viresce）对Bt毒素CrylA产生了高抗性，引起了各国科研人员的关注。近年来，先后有多种昆虫类钙粘蛋白基因被克隆和测序（Gahan et al．，2001：Morin et al．，2003）。 相似文献
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为比较不同长度的插入片段对质粒标准分子储存稳定性的影响,本研究在pEASY-T3质粒载体的基础上,构建了插入片段长度分别为186bp(含Cry1Ab)、273bp(含Cry1Ab和SPS)、880bp(含Cry1Ab、SPS、fsACP、35S、NOS和NPTII)的质粒标准分子(以下简称186、273和880)。利用荧光定量PCR技术分析3个质粒标准分子中不同基因片段在不同存储温度(-70、-20和4℃)和不同存储时间(1、3、7、14、21、28d和3、6、12个月)时的稳定性差异。结果表明:Cry1Ab的Cq(quantification cycle)值在质粒186和273中在所有3个温度条件下6个月内均保持稳定,而在12个月时,Cq值快速上升,显著高于其他时期(P<0.05);而在质粒880中的Cry1Ab的Cq值在各温度下稳定3个月就快速升高,显著高于其他时期(P<0.05)。SPS的Cq值在质粒273中在3个温度下能稳定保持6个月,SPS、fsACP、35S、NOS和NPTII片段的Cq值在质粒880中仅能稳定保持3个月。研究结果表明:含较短插入片段的质粒标准分子的稳定性高于含较长插入片段的质粒标准分子,且同一质粒标准分子中不同片段间的稳定性也存在差异。研究为质粒标准分子储存稳定性(保质期)的研究提供科学依据,同时为质粒标准分子候选物的选择提供实验参考。 相似文献