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1.
铁皮石斛SCoT-PCR反应体系构建及优化 总被引：3，自引：0，他引：3
采用正交设计和单因素试验相结合的方法,对铁皮石斛的SCoT-PCR反应中5个因素(DNA 模板、Mg2+、dNTPs、Taq 酶和引物)进行优化试验。建立了适合铁皮石斛既稳定且多态性高的SCoT-PCR的最佳反应体:20μl PCR反应体系中含有1×Buffer、30ng DNA 模板、2.5mmol·L-1Mg2+、0.15mmol·L-1 dNTPs、1.5U Taq DNA聚合酶和0.4μmol·L-1引物。对铁皮石斛的SCoT-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现本试验引物S6的退火温度为54.5℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的SCoT-PCR反应体系在32份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和重复性。该优化的SCoT-PCR反应体系为进一步进行铁皮石斛种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的分析奠定了技术基础。 相似文献
2.
药用菊花SRAP-PCR反应体系的优化 总被引：2，自引：1，他引：1
基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg2+、dNTP、引物和模板DNA等5因素4水平对药用菊花反应体系进行优化。结果标明：药用菊花SRAP-PCR的最佳反应体系为：在20μL的反应体系中,模板DNA 60ng,Taq酶1.00U,Mg2+ 2.00mmol•L-1,dNTP 0.20mmol•L-1,引物0.40μmol•L-1。Taq酶、Mg2+、dNTP和引物对SRAP反应结果有显著影响。所建立的药用菊花SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。 相似文献
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4.
为了应用ISSR分子标记对茄子(Solanum melongena L)种资源进行种质鉴定、分类及亲缘关系等方面的研究，本试验以茄子叶片为材料，探索茄子DNA的提取及ISSR反应的最佳体系。结果表明利用改良CTAB法提取DNA，可以消除茄子叶片多糖、多酚、色素等物质的干扰，得到高质量的DNA，完全符合ISSR反应需要。以茄子基因组DNA为模板，通过正交试验设计，从Taq酶、dNTP、引物、模板4种因素3个水平对茄子ISSR反应体系进行优化，建立了一套适宜于茄子的ISSR优化反应体系及程序，为进行茄子遗传多样性的研究奠定了基础。在20μL的反应体系包括：Taq酶1 U，Mg2+2. 5mmol/ L，dNTP 375μmol/ L , 引物浓度0.4μmol/ L，模板DNA 4ng，2μL 10×PCR Buffer（Mg2+）。 相似文献
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根瘤菌RAPD引物筛选及条件优化 总被引：3，自引：0，他引：3
用改良的SDS-CTAB酶裂解法提取了根瘤菌基因组DNA的模板,从100个10bp的随机引物中筛选出了16条在20个菌株上均能扩增出清晰的片段。应用L16(45)正交表研究了DNA模板、Mg2+、Taq酶d、NTPs和引物浓度对扩增迁移率重现性的影响,用这种方法建立的根瘤菌RAPD-PCR优化反应体系为:20μl体系中含2.5mg/L的DNA模板、2.00mmol/L的Mg2+、1.00U的Taq酶、0.05mmol/L dNTPs、0.35μmol/L随机引物。 相似文献
6.
柿和君迁子SSR分析技术的建立 总被引：15，自引：0，他引：15
通过搜寻核酸数据库中柿属植物核苷酸序列,利用Sputnik程序查找微卫星,利用Primer Premier 5.0软件设计特异微卫星引物,并对影响PCR扩增的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度,以及退火温度等因素进行优化.最终确定柿(Diospyroskaki)和君迁子(D.lotus)SSR-PCR最佳反应体系为模板DNA30 ng,Buffer1×,Mg2+2.5mmol/L,dNTPs0.2mmol/L,Taq DNA酶1 U,引物0.3 μmol/L,反应总体积20μL,退火温度50℃. 相似文献
7.
柿属植物ISSR分析技术的建立 总被引：15，自引：0，他引：15
以部分柿属(Diospyros)植物为材料,对ISSR-PCR反应体系腗g2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶浓度,退火温度及扩增循环次数进行了探讨,确立了适合柿属植物ISSR分析技术体系在25 μL反应体系中,含1× Buffer,Mg2+2.0或2.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.6 μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,甲酰胺2%,模板DNA 2.4 ng/μL;PCR扩增程序94℃变性3 min;94℃ 30 s,(Tm+2)℃(根据引物不同设定)45 s,72℃1.5 min,35个循环;72℃延伸7 min;2%琼脂糖电泳分离PCR产物.结果为柿属植物遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持. 相似文献
8.
本试验以雁鹅基因组DNA为模板,采用正交试验设计L25（55）对PCR反应中5个因素（引物、dNTPs浓度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶）在5个水平上进行优化实验,在初步实验的基础上通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,快速准确地建立雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系,为进一步进行雁鹅遗传多样性的研究、遗传图谱构建和基因定位奠定技术基础。在25uL的反应体系中,确定雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系为：ISSR引物的浓度为0.20umol/L,dNTPs浓度为0.28mmol/L,模板DNA的用量为40ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为1.0U。在正交试验设计的基础上,通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,可以更加准确地确立ISSR-PCR的最佳反应体系。 相似文献
9.
为探讨发酵床垫料中微生物16S rDNA基因扩增实验中诸多因素对实验结果的影响,采用单因素法对16S rDNA基因扩增时PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、模板DNA)5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度、循环次数。结果表明:25μL的最佳反应体系为:10×PCR buffer 2.5μL、MgCl22.0 mmol·L-1、dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.2μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 50 ng;最佳反应程序为:在94℃下进行4 min预变性;随后循环扩增25个循环(包括94℃变性45 s,53.7℃退火30 s,72℃延伸90 s);最后在72℃下延伸10 min。 相似文献
10.
为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16（45）正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2＋2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。 相似文献
11.
本研究主要建立毛薯ISSR-PCR的最佳反应体系。研究采用改良CTAB法提取毛薯总基因组DNA,应用单因子实验法设定模板DNA,Mg2＋浓度,dNTP浓度,Tap酶浓度以及退火温度的5个不同梯度,探讨单因素变化对毛薯ISSR-PCR扩增的影响。实验结果表明,毛薯ISSR-PCR最佳反应体系为：总体积20μL,模板DNA为50ng、Taq酶为0.8U、Mg2＋浓度为2.0mmol/L、引物浓度为0.5μmol/L、dNTPs浓度为0.5mmol/L。 相似文献
12.
本研究以毛竹叶片DNA为模板,利用均匀设计U10（54）表,对毛竹EST-SSRPCR反应体系的TaqDNA聚合酶、Mg2＋、dNTPs及引物浓度4因素5个水平进行优化筛选。优化实验结果表明,毛竹EST-SSRPCR的25μL优化反应体系为：10×PCRBuffer（含Mg2＋）2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5U,Mg2＋、dNTPs及引物的最适浓度分别是1.0mmol/L、0.1mmol/L、0.48μmol/L;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为52.4℃。对优化出的EST-SSRPCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰可辨的DNA谱带。该优化体系为利用EST-SSR分子标记对毛竹进行遗传多样性等相关研究工作提供了基础条件。 相似文献
13.
SRAP-PCR反应体系的优化是SRAP分子标记的基础,为建立高效稳定的唐古特大黄SRAP反应体系,进一步对唐古特大黄进行遗传多样性、种质资源分析,本研究在单因素试验基础上,对唐古特大黄SRAP-PCR反应体系主要影响因素Mg~(2+)、d NTPs、引物、Taq酶进行正交试验L9(34)。结果表明,唐古特大黄最佳SRAP-PCR反应体系为:Mg~(2+)0.5 mmol·L~(-1),d NTPs 0.4 mmol·L~(-1),引物0.2μmol·L~(-1),Taq聚合酶0.06 U·μL~(-1),总体积25μL。利用最优体系进行引物筛选,从58对SRAP引物中获得了30对条带清晰、多态性好的引物对组合。SRAP-PCR优化反应体系的建立为利用SRAP技术进行唐古特大黄种质资源分析、遗传多样性研究等奠定了基础。 相似文献
14.
目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism,SCo T)是一种新型的遗传分子标记技术。本研究采用单因素水平设计方法,优化并建立梨的适宜SCo T分子标记体系,通过SCo T标记技术,分析了安徽省砀山县的43份梨(Pyrus spp.)的遗传多样性和亲缘关系。结果表明,优化后梨SCo T-PCR反应体系:10×Easy Taq Buffer(含2 mmol/L Mg2+)2.5μL,模板DNA终浓度30 mg/L,上下游引物终浓度1.0μmol/L,d NTPs终浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积为25μL。随机选取2个DNA模板进行引物筛选,最终从67条引物中筛选出16条扩增条带清晰且有差异性的引物,共扩增出145条带,其中多态性条带有126条,多态性比率为86.1%,每条引物平均扩增出9.1条带。SCo T标记的43个梨材料遗传相似性系数为0.517~0.931,平均值为0.685。聚类分析表明,在遗传相似系数为0.610的水平上,43份梨材料分为A和B两组;在遗传相似系数为0.746的水平上,A组又分为6个亚组(Ⅰ~Ⅵ)。所研究的43份梨材料具有丰富的遗传多样性,且能够被SCo T分子标记有效地检验,为进一步研究利用安徽省砀山县梨种质资源提供了依据。 相似文献
15.
《核农学报》2017,(11)
为建立并优化适合花生的EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶组合的AFLP标记技术体系,本试验对花生基因组DNA大样提取方法、双酶切反应、连接体系、预扩增和选择性扩增等影响因素进行反复调试与优化,并对适合花生AFLP分析的引物组合(E/M)进行多态性筛选。结果表明,高质量的模板DNA提取采用改进的SDS-CTAB法,DNA样品的浓度在150~200 ng·μL~(-1),37℃双酶切3.0 h,接头浓度为50pmol·μL~(-1),T4-DNA连接酶浓度为10 U·μL~(-1),16℃连接10 h。以2×Es Taq MasterMix(含有Es Taq DNA Polymerase,3 mmol·L~(-1)MgCl_2和400μmol·L~(-1)d NTP)作为PCR反应原料,其中,预扩增反应体系为50μL,预扩增引物(E00和M00)的浓度为50 ng·μL~(-1),预扩增产物最适稀释倍数为20倍;选择性扩增反应体系为20μL,扩增产物中加入10μL Loading Buffer,经95℃变性10 min后,立刻转移到冰浴中冷却备用。最终,从225对AFLP引物组合中,筛选出稳定且多态性丰富的42对引物组合,可用于后期作图群体基因型检测和种质资源遗传多样性分析。本研究结果为下一步构建花生高密度遗传连锁图谱和开展分子标记辅助育种奠定了基础。 相似文献
16.
采用L16（45）正交设计试验对东兴金花茶SSR-PCR反应的五因素（Mg^2＋,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA浓度）四水平进行了优化试验,然后利用优化后的反应体系,将31对同属植物SSR引物（4对茶树,7对山茶和20对金花茶引物）运用于东兴金花茶材料上,筛选适宜东兴金花茶遗传分析的SSR引物。结果表明,东兴金花茶最佳反应体系（15μL）及扩增条件为：Mg^2＋1.50 mmol/L、dNTP 0.30 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq酶0.75 U、模板DNA 40.00 ng;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s（因引物而异,该温度为引物CN10的退火温度）,72℃延伸40 s,共36个循环;72℃最后延伸10 min。山茶属的不同植物之间可以共享部分SSR引物信息,东兴金花茶获得了9对能扩增出条带清晰且具有多态性的引物,引物最适退货温度为54-60℃,观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）分别为0.433-1.000和0.391-0.932。本试验为下一步进行的东兴金花茶遗传多样性分析、遗传图谱的构建等研究奠定了基础。 相似文献
17.
本试验利用L16（4^5）正交试验设计探寻葡萄SRAP—PCR反应体系中的关键因子,同时结合单因素试验简单、快捷的特点逐个对PCR反应体系的主要成分进行优化。充分利用两种方法的优点并降低试验工作量取得了较好的效果,建立了适于葡萄的SRAP反应体系。结果表明Mg^2＋浓度为影响葡萄SRAP—PCR反应的关键因素;优化的20μLSRAP—PCR反应体系中各组分的最适含量为：10×Buffer2．0μL,Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0.3mmol／L,引物0．4μmol／L,砌DNA聚合酶1．0U,模板DNA1．0ng／μL。利用SRAP反应体系,从100对SRAP引物组合中筛选出扩增稳定,条带清晰,多态性好的引物19对。本研究建立的适于葡萄SRAP—PCR扩增的反应体系,将为葡萄种质遗传多样性评价、基因组分析、指纹图谱构建,分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础。 相似文献
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本研究应用正交设计法对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行了优化筛选,确立了适合月季ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明,25μL的ISSR反应体系中各组分的最适浓度分别为：1×PCR缓冲液、1U Taq DNA聚合酶、800pmol／L 引物、0.16mmol／L dNTPs、Mg^2＋ 1.5mmol／L。筛选了33个ISSR引物,共得到了11个多态性比较高的ISSR引物,占所筛引物的33.33％。利用筛选出的11条ISSR引物对3种月季类型的23份月季材料进行遗传多样性分析,共扩增出477条DNA带,其中多态性位点有14个,平均每条引物可以检测到4.5个多态性位点。用NTSYS软件对样品进行了UPGMA聚类分析,聚类结果表明丰花月季基本能聚为一类,切花月季与藤本月季交叉聚在一起。这表明月季种质的遗传差异与其应用分类的相关性不紧密。 相似文献
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鲢微卫星标记的荧光多重PCR体系建立及其应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了提高鲢微卫星(SSR)分型效率,本研究从已开发 SSR 标记中筛选出 14 对具有高多态性和扩增稳定性的SSR 引物,并组成一个四重 PCR(A)和两个五重 PCR(B 和 C)。以单对引物 PCR 为对照,对多重 PCR 的条件进行优化,包括退火温度、Taq DNA 聚合酶浓度、dNTPs 浓度、Mg2+浓度、PCR Buffer 使用量等。优化结果为,各体系最佳退火温度时,25 μL体系中包括 2 U Taq DNA 聚合酶,0.4 mmol/LdNTPs,2.3 mmol/L Mg2+,以及 3 μL的 10×PCR Buffer。优化后的多重 PCR 扩增稳定,各对引物扩增良好,SSR分型效率显著提高。利用建立的多重 PCR 体系对采自石首老河四大家鱼原种场和监利老江河四大家鱼原种场各 100 尾鲢(Hypophthalmichthys molitrix)样本进行 SSR 分析。结果显示,石首和监利两个原种场的样本都保持有较高的遗传多样性,其中观测杂合度分别是 0.8479 和 0.9443,期望杂合度分别为0.7967 和 0.8134。群体间分子方差分析(AMOVA)FST=0.00613,说明两个原种场鲢群体间没有发生遗传分化。本研究最终建立了三个准确、稳定的荧光标记多重 PCR 体系,具有较大应用价值。运用建立好的 3 个荧光标记多重PCR 对 2 个鲢群体进行遗传多样性分析,结果为两处原种场的进一步科学管理提供了可靠依据。 相似文献
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本实验对影响SRAP-PCR体系中的Mg2＋、dNTPs和引物浓度等因子进行了体系优化,建立了一套适合白簕SRAP检测的25μL反应体系：1.5mmol/LMg2＋,1.5mmol/LdNTPs,1μmol/L引物,10ng模板DNA,1.5UTaqDNA聚合酶;进一步以白梗簕菜为模板,利用优化的体系进行多态性标记引物组合分析,共筛选出17对引物;利用这些引物对7个白簕品种进行SRAP遗传多样性分析,共扩增出461条谱带。其中多态性谱带155条,多态性谱带比率为33.6%,白簕品种间的相似系数为0.7077~0.9474。经UPGMA聚类分析结果显示,所检测的7个白簕品种分为两大类,其中亲缘关系较近的青梗簕菜和细叶密刺簕菜聚成了一组;而其余的4个种,包括白梗簕菜、细叶小刺簕菜、紫柄簕菜、大叶大刺簕菜和红梗簕菜,聚成另一组。 相似文献