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1.
酶是８０年代初期发现的具有自催化活性的ＲＮＡ片从核酸水平来破坏对人体不利的基因在人细胞内的表达,这是一种比较专一,且对人体危害相对较小的一种方式,经过改诉核酶不仅能起顺式作用,更重要的是也能以反式作用,这样就使得人们能够设计出针对ＲＮＡ的各种具有治疗作用的核酶,该文着重介绍具锤头型结构域和发夹型结构域的２类核酶的设计,及核酶作为治疗药物所要考虑的一些问题。 相似文献
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脱氧核酶对端粒酶hTERT mRNA的切割以及对鼻咽癌细胞凋亡相关基因的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
目的:探讨脱氧核酶对端粒酶蛋白亚基hTERTmRNA的切割作用及对人鼻咽癌细胞凋亡相关基因表达的影响。方法:针对hTERT基因的核苷酸序列,合成“10～23”型脱氧核酶及其类似物,提取总RNA在体外切割hTERTmRNA;转染鼻咽癌细胞后,用RT-PCR扩增hTERT基因片段,用PCR-ELISA法测定端粒酶活性,用RT-PCR和荧光免疫测定凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果:未经修饰的脱氧核酶DzT和在DzT的3'末段添加倒位连接T碱基的脱氧核酶DzTi在体外能够有效地切割hTERTmRNA;在转染鼻咽癌细胞后,DzTi比DzT对hTERTmRNA表现出更强的切割作用,DzTi能够显著地降低鼻咽癌细胞端粒酶活性(P<0.01)、抑制鼻咽癌细胞的生长(P<0.05)和bcl-2基因的表达(P<0.05),上调bax基因的表达(P<0.05)。DzT和DzTi的催化中心的一个碱基被替换后形成的脱氧寡核苷酸DzT'和DzTi'在体外和胞内均不表现对hTERTmRNA的切割作用。结论:人工合成的脱氧核酶确实能够高效特异地切割端粒酶hTERTmRNA,并降低鼻咽癌细胞的端粒酶活性,促进鼻咽癌细胞凋亡。作为一种新发现的催化性核酸,脱氧核酶在肿瘤的基因治疗领域中将具有极其重要的应用价值。 相似文献
3.
设计靶向EGFR mRNA的脱氧核酶(EGFR DRz)，以壳寡糖(COS)为材料，建立了一种有效的纳米基因细胞内传递体系，并研究其介导的靶向EGFR的脱氧核酶在Hela细胞内的生物学效应.流式结果表明COSEGFR DRz复合体转染效率为88.7%，与脂质体转染试剂的89.7%相比无显著差异.半定量RTPCR结果显示，经壳寡糖纳米载体递送的EGFR DRz能有效地靶向切割Hela细胞内的EGFR mRNA，使其表达下降.进一步的流式分析显示细胞被阻滞在G0~G1期，并且出现凋亡现象，其中COS组的凋亡率为19.3%，大于对照组脂质体的凋亡率13.0%.研究表明，COS较脂质体有相似的转染效率和更低的毒性，是一种潜在的、有效的脱氧核酶递送载体. 相似文献
4.
[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。 相似文献
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[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并用检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。 相似文献
6.
【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）拯救平台，为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDV Gt株全基因组中引入分子标签（A节段：EcoR V酶切位点；B节段：PstI酶切位点）。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构（HamRz）和丁肝病毒核酶结构（HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，LipofectamineTM2000介导共转染DFI细胞，进行病毒拯救研究。 【结果】 构建的IBDV感染性克隆可在DFI、Vero/E6、Vero/P12等3种细胞上高效拯救出病毒。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE，且TCID50与亲本毒差异不显著，具有相似的生物学特征。【结论】构建的RNA聚合酶ⅢBDV拯救系统高效、稳定、简便、经济，且具有良好的细胞普适性。 相似文献
7.
Ⅱ型内含子除具有核酶的特性之外,还可作为一种可移动的元件特异性地转移到基因组序列中,其转移过程需要内含子RNA和内含子编码蛋白质（IEP）来识别靶标位点,内含子已经作为一种新型的基因打靶工具应用于原核生物的基因插入失活和特定的基因敲除,并在真核生物基因组的功能基因组学和基因治疗中展现了广阔的应用前景。 相似文献
8.
利用配体交换反应将巯基修饰的“8-17”脱氧核酶(“8-17”DNAzyme/“8-17”Dz)底物链（17S）通过Au S共价键自组装在纳米金胶（AuNPs）表面,制得一种新型纳米复合物17S AuNPs。利用紫外 可见吸收光谱和动态光散射（dynamic light scattering, DLS）对其进行了表征。紫外 可见吸收光谱表明17S AuNPs在523 nm波长处有表面等离子共振峰,较AuNPs红移了3 nm;经DLS测定的17S AuNPs的流体动力学平均直径为38.6 nm,较 AuNPs的21.8 nm增大了16.8 nm。另外,利用紫外 可见光谱和目视比色法对AuNPs和17S AuNPs的耐盐稳定性分别进行了比较研究,结果表明：随着水溶液中Na+浓度的逐渐提高,AuNPs在600 nm处的吸收峰不断增强,溶液颜色逐渐由红变成蓝紫色;而17S AuNPs在600 nm处并未出现吸收峰,且溶液颜色一直保持为红色;表明17S AuNPs纳米复合物的稳定性较AuNPs显著提高。 相似文献
9.
《东北农业大学学报》2020,(3)
利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在Lager型啤酒酵母(Saccharomyces pasteurianus)中建立CRISPRCas9基因敲除系统。将质粒pMY中毕赤酵母基因表达系统中常用GAP启动子替换为酿酒酵母基因表达系统中常用PGK1启动子,增强外源基因表达量。设计酿酒酵母(S. cerevisiae)基因组及真贝酵母(S. eubayanus)基因组中目的基因TRP1小向导RNA。增加向导RNA结构中锤头状核酶和肝炎三角洲病毒核酶结构,提高gRNA转录水平。Lager型啤酒酵母Pilsner中TRP1基因被敲除,成功构建Lager型啤酒酵母中CRISPR-Cas9基因敲除系统。 相似文献
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《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2018,(6)
通过构建A型流感病毒H1N1感染小鼠模型,并使用c-Jun蛋白的特异性核酶Dz13抑制该蛋白的表达,探索c-Jun蛋白在流感病毒感染后对T淋巴细胞增殖和炎性反应的调节作用。蛋白质印迹法(Western-blotting)结果表明,核酶Dz13作用后c-Jun蛋白的表达量明显降低,且c-Jun蛋白的活化也随之降低。此外,用流式细胞术测定感染后3 d和6 d外周血内辅助性T细胞(CD4~+T)和杀伤性T细胞(CD8~+T)的增殖情况,同时用实时荧光定量聚合酶链式反应测定外周血内细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10表达。结果显示:小鼠感染病毒后,外周血CD4+和CD8+T细胞明显增多,相关细胞因子的表达量也明显上调;而抑制c-Jun蛋白表达后,CD4~+和CD8~+T细胞的增殖受到抑制,且相关细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-10的表达量亦受到抑制。说明c-Jun蛋白参与调节A型流感病毒H1N1感染后引起的T淋巴细胞增殖和相关细胞因子的表达。 相似文献
11.
简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略,主要有:植物自身的抗病毒基因策略、来源于病毒的抗性基因策略、干扰素、核酶等抗性策略;并分析了其存在问题及发展趋势。 相似文献
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A critical event in the origin of life is thought to have been the emergence of an RNA molecule capable of replicating a primordial RNA "genome." Here we describe the evolution and engineering of an RNA polymerase ribozyme capable of synthesizing RNAs of up to 95 nucleotides in length. To overcome its sequence dependence, we recombined traits evolved separately in different ribozyme lineages. This yielded a more general polymerase ribozyme that was able to synthesize a wider spectrum of RNA sequences, as we demonstrate by the accurate synthesis of an enzymatically active RNA, a hammerhead endonuclease ribozyme. This recapitulates a central aspect of an RNA-based genetic system: the RNA-catalyzed synthesis of an active ribozyme from an RNA template. 相似文献
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Kinetic characterization of ribonuclease-resistant 2'-modified hammerhead ribozymes 总被引：36，自引：0，他引：36
The incorporation of 2'-fluoro- and 2'-aminonucleotides into a hammerhead ribozyme was accomplished by automated chemical synthesis. The presence of 2'-fluorouridines, 2'-fluorocytidines, or 2'-aminouridines did not appreciably decrease catalytic efficiency. Incorporation of 2'-aminocytidines decreased ribozyme activity approximately by a factor of 20. The replacement of all adenosines with 2'-fluoroadenosines abolished catalysis in the presence of MgCl2 within the limits of detection, but some activity was retained in the presence of MnCl2. This effect on catalysis was localized to a specific group of adenines within the conserved single-stranded region of the ribozyme. The decrease in catalytic efficiency was caused by a decrease in the rate constant; the Michaelis constant was unaltered. The 2'-fluoro and 2'-amino modifications conferred resistance toward ribonuclease degradation. Ribozymes containing 2'-fluoro- or 2'-aminonucleotides at all uridine and cytidine positions were stabilized against degradation in rabbit serum by a factor of at least 10(3) compared to unmodified ribozyme. 相似文献
14.
Pyle AM 《Science (New York, N.Y.)》2005,309(5740):1530-1531
The number of naturally occurring RNA enzymes has just been expanded by the discovery of a new branching ribozyme. But this ribozyme has unexpected relatives: group I introns. 相似文献
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Zhuang X Bartley LE Babcock HP Russell R Ha T Herschlag D Chu S 《Science (New York, N.Y.)》2000,288(5473):2048-2051
Using fluorescence microscopy, we studied the catalysis by and folding of individual Tetrahymena thermophila ribozyme molecules. The dye-labeled and surface-immobilized ribozymes used were shown to be functionally indistinguishable from the unmodified free ribozyme in solution. A reversible local folding step in which a duplex docks and undocks from the ribozyme core was observed directly in single-molecule time trajectories, allowing the determination of the rate constants and characterization of the transition state. A rarely populated docked state, not measurable by ensemble methods, was observed. In the overall folding process, intermediate folding states and multiple folding pathways were observed. In addition to observing previously established folding pathways, a pathway with an observed folding rate constant of 1 per second was discovered. These results establish single-molecule fluorescence as a powerful tool for examining RNA folding. 相似文献
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为了建立传染性法氏囊病病毒反向遗传系统,应用PCR法在鸡传染性法氏囊病病毒基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入T7启动子和核酶HDV序列,然后分别将含有T7启动子和核酶HDV序列的A、B节段构建到载体PT-Pluc当中,构建感染性载体PT-mA和PT-mB.在脂质体介导下将PT-mA和PT-mB共转染经痘病毒vTF7-3(含T7 RNA聚合酶基因,能稳定表达T7 RNA聚合酶)预先感染1 h的vero细胞.细胞病变观测、间接免疫荧光试验、电镜观察和分子标记检测证实成功实现了鸡传染性法氏囊病病毒的遗传拯救. 相似文献
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The glmS ribozyme is the only natural catalytic RNA known to require a small-molecule activator for catalysis. This catalytic RNA functions as a riboswitch, with activator-dependent RNA cleavage regulating glmS messenger RNA expression. We report crystal structures of the glmS ribozyme in precleavage states that are unliganded or bound to the competitive inhibitor glucose-6-phosphate and in the postcleavage state. All structures superimpose closely, revealing a remarkably rigid RNA that contains a preformed active and coenzyme-binding site. Unlike other riboswitches, the glmS ribozyme binds its activator in an open, solvent-accessible pocket. Our structures suggest that the amine group of the glmS ribozyme-bound coenzyme performs general acid-base and electrostatic catalysis. 相似文献