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1.
尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是世界水产养殖业中的重要经济鱼类,但在养殖生产中易受海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染而致病致死,使用疫苗是一种相对理想的防感染措施。该研究采用海豚链球菌simA、pgmA基因构建的真核表达载体作为DNA疫苗,肌肉注射罗非鱼评估疫苗保护效果。免疫后在DNA和RNA水平上,在注射鱼体内检测到2个目的基因。首次免疫后第7至第28天,鳃、肝、肾脏、头肾中疫苗组的白介素1 (Interleukin,IL-1β)与肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)表达量高于PBS对照组;疫苗组的抗体滴度、血清抗菌活性显著(P<0.05)高于PBS对照组。攻毒后,注射pcDNA3.1-pgmA、pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA与pcDNA3.1-simA等比例混合疫苗的相对保护率(Relative percent survival,RPS)分别为60.7%、49.9%和75.0%。结果表明所制备的疫苗具有免疫保护效果,可作为候选疫苗。 相似文献
2.
ＤＮＡ疫苗也称核酸疫苗、基因疫苗 ,是将含有编码保护性抗原蛋白的基因序列和表达所必需调控元件的质粒ＤＮＡ直接导入动物组织 ,使抗原蛋白经过内源性表达并递呈给免疫系统 ,诱发机体产生特异性体液免疫和细胞免疫应答 ,形成对相应病原的免疫保护作用 ,用于免疫的质粒ＤＮＡ称为ＤＮＡ疫苗。它不同于传统的弱毒疫苗、灭活疫苗及亚单位苗 ,是带有特异性抗原基因的真核表达质粒 ,是继病原体疫苗、亚单位疫苗之后的第 3代疫苗[1] 。ＤＮＡ疫苗在人体和哺乳动物研究中已取得一定进展 ,部分疫苗已进入临床试验阶段[2 ] 。而鱼类ＤＮＡ疫苗的研… 相似文献
3.
为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护.PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达.ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体.攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致病性溶藻弧菌的感染.结果表明,质粒pcDNA-flaC可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的疫苗候选物. 相似文献
4.
Ⅱ型干扰素,也称干扰素-γ（IFN-γ）,是参与辅助性T淋巴细胞1（Th1）免疫应答的关键细胞因子之一。研究表明,鱼类与哺乳类Ⅱ型干扰素同源,不同的是真骨鱼类（Teleost）有两种Ⅱ型干扰素,即IFN-γ和干扰素-γ相关因子（IFN-γrel）。迄今,对鱼类IFN-γ基因的表达规律和功能已有大量报道,而对IFN-γrel的研究尚不深入,产生IFN-γ和IFN-γrel的细胞来源不清楚,它们是否有功能差异也存在争议。为此,本研究构建原核表达质粒,在大肠杆菌DE3中表达草鱼（Ci）IFN-γ和CiIFN-γrel重组蛋白。实验结果显示,重组CiIFN-γ蛋白为可溶性蛋白,而CiIFN-γrel蛋白则不可溶。通过亲和层析和分子筛层析获得了高纯度CiIFN-γ和CiIFN-γrel重组蛋白,免疫小鼠制备了单克隆抗体。通过Western Blotting筛选获得4株特异性高、亲和力强的抗体,结果表明CiIFN-γ单克隆抗体与CiIFN-γrel没有交叉反应,反之亦然,其中FITC标记的两株抗体可用于免疫荧光和流式细胞术分析。此外,Western Blotting分析显示草鱼IFN-γ和IFN-γrel单克隆抗体不识别斑马鱼的同源Ⅱ型干扰素蛋白。本研究制备了首个IFN-γrel的单克隆抗体,为深入研究草鱼Ⅱ型干扰素的产生和生物学功能奠定基础。 相似文献
5.
参照GeneBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp,编码214个氨基酸。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a( ),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为温度37 ℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1:30,000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原。为了进一步研究哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护效果,构建了真核表达重组质粒pCDNA-OmpW,然后将真核质粒免疫接种红笛鲷。PCR结果显示,免疫接种第7、28 d,在红笛鲷的肌肉、头肾、肝脏和脾脏组织均存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种第7、28 d,红笛鲷不同组织均有目的基因的表达。ELISA结果表明,红笛鲷体内血清产生了抗OmpW蛋白的高效价抗体。Western- blot分析表明,DNA疫苗免疫后红笛鲷体内表达了相应的目的蛋白,并诱导产生了相应抗体。攻毒试验结果表明,免疫保护率高达60 %,可见pCDNA-OmpW可作为红笛鲷预防哈氏弧菌感染的有效候选疫苗之一。 相似文献
6.
根据CCVORF6基因序列,设计合适的引物,扩增ORF6基因,分别将其克隆到自杀性DNA疫苗载体pS-FV与常规DNA疫苗载体pcDNA3.1(+)中,转化感受态细胞DH5α后提取质粒,构建斑点叉尾鮰(Ictalurus punc-tatus)自杀性DNA疫苗ps-ORF6与常规DNA疫苗pcd-ORF6,利用转化后的大肠杆菌菌液为模板进行PCR扩增、提取质粒酶切鉴定以及序列测定等方法证实重组质粒构建正确。将重组质粒转染人胚肾细胞(293T),间接免疫荧光试验表明ORF6均获得表达,但自杀性DNA疫苗的表达效果不如常规DNA疫苗,该研究为这2种疫苗进一步的鱼体试验奠定了基础。 相似文献
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根据CCVORF6基因序列,设计合适的引物,扩增ORF6基因,分别将其克隆到"自杀性"DNA疫苗载体pS-FV与常规DNA疫苗载体pcDNA3.1(+)中,转化感受态细胞DH5α后提取质粒,构建斑点叉尾鮰(Ictalurus punc-tatus)"自杀性"DNA疫苗ps-ORF6与常规DNA疫苗pcd-ORF6,利用转化后的大肠杆菌菌液为模板进行PCR扩增、提取质粒酶切鉴定以及序列测定等方法证实重组质粒构建正确。将重组质粒转染人胚肾细胞(293T),间接免疫荧光试验表明ORF6均获得表达,但"自杀性"DNA疫苗的表达效果不如常规DNA疫苗,该研究为这2种疫苗进一步的鱼体试验奠定了基础。 相似文献
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本研究以传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)分离株XJ-13为研究对象,克隆其糖蛋白(glycoprotein,G)基因并连接到商业化载体pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pIHNxj-G。为了检测该载体作为核酸疫苗的可能性,本研究以2μg/尾的剂量采用背鳍基部注射免疫虹鳟(Oncorhynchus mykiss)鱼苗[(5±0.5)g]。在免疫后第4天及第30天,以100 TCID_(50)的剂量利用IHNV-XJ-13对虹鳟进行腹腔注射攻毒;在免疫后第4天及第7天,利用Real-time PCR技术检测虹鳟头肾及接种部位肌肉组织Mx-1基因表达情况;在免疫后第4天及30天检测虹鳟血清IHNV中和抗体效价;在免疫后65 d内,分别于不同时间点采集循环水池里的粪便、水以及虹鳟的肠内容物,进行氨苄青霉素抗性菌的分离鉴定。攻毒试验结果显示,核酸疫苗在免疫后第4天和第30天的相对保护率均高于90%;Mx-1基因检测结果显示,Mx-1基因在头肾和接种部位肌肉中均显著上调表达;中和抗体效价测定结果显示,在免疫后第4天,所有血清中均不存在中和抗体(效价均20);而在免疫后第30天,10尾虹鳟中有8尾血清中存在中和抗体,最高效价为160;抗性菌分离结果显示,分离到的氨苄青霉素抗性菌均是天然具有氨苄青霉素抗性的气单胞菌(Aeromonas sp.)和柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.),并未分离到包括大肠杆菌在内的任何具有氨苄青霉素抗性的指示菌,且实验组和对照组的氨苄青霉素抗性菌的种类和数量均没有发生统计学意义的改变。本研究提供了具有良好保护效果的IHN核酸疫苗,并为IHN核酸疫苗的安全评价提供了基础数据。 相似文献
9.
鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)能够引起鲫大量死亡,严重威胁我国水产养殖业的健康发展,目前,针对CyHV-2尚无有效的商业化疫苗或治疗措施。为构建CyHV-2DNA疫苗,本研究将其衣壳蛋白ORF66编码基因克隆至pVAX1真核表达载体上,构建重组质粒pVAX-ORF66。此外,在BL21(DE3)pLysS中对ORF66蛋白进行了原核表达,表达蛋白经纯化后免疫新西兰白兔制备了ORF66特异性抗体。酶联免疫吸附(ELISA)检测显示,制备抗体效价达1∶20000以上。将pVAX-ORF66质粒转染金鱼脑细胞系(GFB),利用制备的ORF66抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测,结果显示,ORF66蛋白可以在细胞中大量表达,且主要定位于细胞质中。将pVAX-ORF66质粒肌肉注射鲫后进行CyHV-2免疫保护实验,结果表明,其相对免疫保护率达55.6%。本研究针对CyHV-2构建了一种制备简单、成本低廉的DNA疫苗,为鲫造血器官坏死病的免疫预防及感染分子机制研究奠定了前期实验基础。 相似文献
10.
为了研究无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护作用,本研究通过PCR和重叠延伸拼接技术(SOEing)获得融合基因Sip-GAPDH,连接至真核表达载体pcDNA3.1(+)制备DNA疫苗,通过背鳍肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼,免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip-GAPDH在各个组织(包括肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏)中的表达情况。采用ELISA、Real-time PCR法和体外攻毒法分别分析各实验组不同时间血清抗体效价、免疫基因(IgM、IL-1β和CD8)表达变化规律和相对保护率,研究该嵌合性疫苗对吉富罗非鱼的保护效果。结果显示,实验组在免疫接种第7和第28天时,注射点周围的肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏均能检测到嵌合性质粒,实验组罗非鱼血清抗体效价均高于对照组并于21 d时达到峰值(1∶4 096);qPCR数据表明,实验组鱼体胸腺、头肾和脾脏的IgM、IL-1β和CD8基因的mRNA表达量均出现了上调,并且在胸腺、头肾和脾脏中的表达量分别在免疫后第12和第48 h达到峰值;免疫后42 d进行人工攻毒后计算免疫保护率为93.3%。以上研究结果表明,本研究构建的无乳链球菌Sip-GAPDH嵌合核酸疫苗在罗非鱼链球菌病防治中具有潜在的应用价值。 相似文献