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本试验旨在优化电转染电压并构建转基因体细胞,为生产转基因广西巴马小型猪打下技术储备。以新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞和pEGFP-N1为材料、以细胞存活率和转染率为电转染效率评价指标,筛选最佳电压,然后用优化电压进行电转染并经G418抗性筛选获得转基因体细胞系,通过体细胞核移植技术获得转基因克隆胚胎。本研究筛选出最佳电压为120 V,用优化电压进行电转染并成功构建表达GFP的转基因细胞,最后通过体细胞核移植成功获得表达GFP的转基因克隆胚胎。结果表明优化的电转染电压可以高效构建广西巴马小型猪转基因体细胞,并可通过体细胞核移植生产转基因克隆胚胎。 相似文献
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基因修饰猪作为一种理想的动物模型已应用于生物医学研究。构建基因修饰猪的方法很多,包括原核注射、慢病毒转染、精子介导和体细胞核移植等,其中体细胞核移植具有显著优势,一直是构建基因修饰猪的重要方法。近几年,随着转座子、设计核酸酶等基因修饰新技术以及诱导性多能干细胞研究的不断进展,将进一步凸显体细胞核移植技术在基因修饰猪构建中的价值。本文比较了猪基因修饰的主要方法,并论述体细胞核移植技术在猪基因修饰中的优势、发展历程和最新应用等。 相似文献
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由于猪的器官极可能成为人类未来器官的供应源,猪体细胞核移殖及转基因等方面的研究已成为全球的热点。近几年来,猪体细胞核移植研究取得了一定的进展,但总体来看核移植效率还很低(1%~2%),还需要不断完善核移植程序及对一些基础问题的深入研究。本文主要对猪体细胞核移植重构胚发育异常及“印迹”基因表达特征作一综述与分析,旨在为研究者提供一些有益的启示。 相似文献
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不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎 总被引：1，自引：0，他引：1
2005年我国获得了体细胞克隆猪的成功,但是在体细胞转基因克隆猪方面还处于起步阶段。猪的转基因克隆在农业和医学方面有着巨大的应用前景,在农业上可以提高猪肉品质和培育抗病猪种等;医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。体细胞核移植结合基因组修饰技术,是目前生产转基因家畜的一种有效方式。供体细胞的类型是影响转基因克隆效率的一个关键因素,因为供体细胞的类型决定着体细胞转基因效率和重组胚的发育潜力。目前所知,较成功用于生产转基因克隆猪的供体细胞仅限于胎儿成纤维细胞,因为它易培养、增殖期限长、重构胚的发育能力高。此外骨髓间充质细胞,一种成体干细胞,作为转基因克隆猪的供体细胞有着巨大的潜力,国内外仅有个别报道。前脂肪细胞,一种易于获得的体细胞,有报道称利用成年猪前脂肪细胞为核供体构建的克隆胚发育能力和胎儿成纤维细胞相当,并且获得了克隆猪的后代。而利用猪前脂肪细胞生产转基因克隆胚胎,将为后续组织工程研究奠定基础。因此本研究选择猪胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞为转基因克隆的供体细胞,目的是比较不同类型转基因供体细胞对生产克隆胚胎效率的影响。本研究首先建立了近交系五指山小型猪(WZSP)胎儿成纤维细胞系(FF)、新生猪骨髓间充质细胞(MSCs)系和成年猪前脂肪细胞系(PreA)。采用组织块法建立胎儿(27日龄)成纤维细胞系;髓间充质细胞从新生猪后腿骨冲取骨髓,加入到Percoll分离液中离心,吸取中间界层面细胞,贴壁法培养骨髓间充质原代细胞,培养基为低糖DMEM。对间充质细胞向脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定;前脂肪细胞从猪的皮下脂肪取样,用0.1%胶原酶消化法建立前脂肪细胞原代细胞,并对前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。为了获得转基因细胞系,利用脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogene)介导的方法将质粒pEGFP-N1转染了胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞,经过800μg/mL G418筛选后均获得了阳性细胞株。分别以3种类型转基因和未转基因细胞为核供体进行猪的体细胞核移植,比较克隆胚胎的发育能力。结果如下:(1)比较了3种类型非转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(8.2%)、骨髓间充质细胞(7.1%)和前脂肪细胞(8.8%)囊胚发育率差异不显著(P>0.05);(2)比较了3种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(9.6%)和骨髓间充质细胞(9.9%)最高,前脂肪细胞(3.7%)最低,前两者与后者差异显著(P<0.05);(3)分别比较了每一类型供体细胞转基因和非转基因对重组胚的囊胚发育率的影响,转基因对胎儿成纤维细胞(9.6%vs 8.2%)和骨髓间充质细胞(9.9%vs 7.1%)的重构胚囊胚发育率影响不大(P>0.05);前脂肪细胞转基因重组胚的囊胚发育率显著降低(3.7%vs 8.8%,P<0.05)。以上结果表明,某些供体细胞类型转基因与否对猪克隆胚胎的早期体外发育影响不明显,有些细胞类型转基因对克隆胚的发育能力影响较大。通过体细胞核移植技术,猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞可以有效地生产猪转基因囊胚,但前脂肪细胞转基因克隆胚胎的囊胚发育率能否进一步提高,还需要进一步的实验观察。 相似文献
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脂质体法是一种传统的向哺乳动物细胞导入外源基因的方法,然而其转染效率受多种因素影响。本研究将从脂质体和质粒DNA量、转染暴露时间以及混合孵育时间等四方面进行探索,以寻找最佳的转染体系。试验结果表明最佳转染体系为：脂质体1.25μL、DNA 0.7μg、脂质体-DNA混合孵育0 min以及转染暴露6 h。随后我们用优化过的转染体系对新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞进行转绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）操作,获得了（26.45±2.11）%的转染率,并以此为核供体经体细胞核移植技术成功构建表达GFP的广西巴马小型猪克隆胚胎,同时证实转基因克隆胚的体外发育能力比得上非转基因克隆胚。这为我们构建用于人类疾病研究的基因修饰广西巴马小型猪奠定了基础。 相似文献
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本研究用体外成熟42-46h的猪卵母细胞为核移植受体,猪颗粒细胞为核移植供体,对猪体细胞核移植的电融合参数进行了探讨。结果发现,当脉冲时间为40μs时,0．77kV／cm组的融合率（59．3％）明显高于1．54kV／cm组（38．6％,P〈0．05）,分裂率（77．8%）及桑椹胚／囊胚发育率（33．3％）显著高于2．31kV／cm组（52．2％,13．6％,P〈0．05）;当电场强度为0．77kV／cm时,20μs组的融合率（68．0％）明显高于30μs组和40μs组（42．7％和35．5％,P〈0．05）,分裂率（89．3％）明显高于脉冲时间为40μs组（60．5％）;当电场强度为0．77kV／cm,脉冲时间为20μs时,电脉冲1次的融合率（72．8％）明显高于电脉冲2次（56．0％,P〈0．05）,在直流电脉冲前是否施加交流电（1．0V）对融合率（70．0％vs76．0％）、分裂率（77．3％vs75．0％）以及胚胎发育率（17．3％vs18．4％）均无显著影响（P〉0.05）。
以上结果表明,在本所实验室条件下,猪体细胞核移植中的适宜电融合参数为：0．77kV／cm,20μs,电脉冲1次,这将为随后的猪体细胞核移植奠定了基础。 相似文献
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通过对猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代的研究,摸索出一套猪体细胞的分离、培养和传代的方法,建立了猪的供体细胞系。研究结果表明:猪的卵丘细胞单层的生长需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞,组织块法单层的生长需要10~11 d,酶消化法需要8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些供体细胞培养方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞材料来源。 相似文献
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通过转基因动物乳腺表达系统生产重组药用蛋白比微生物发酵系统和动物细胞培养系统具有很多优势;同时,体细胞核移植技术为制备动物乳腺生物反应器开辟了一条新的途径。本实验旨在建立稳定整合人乳铁蛋白cDNA的山羊胎儿成纤维细胞系,为体细胞核移植法制备转基因动物提供可靠的供体细胞。本研究采用RT-PCR获得人乳铁蛋白cDNA,通过Long and Acute PCR扩增山羊β-酪蛋白5’ 端6.5 kb的调控序列,以pEGFP-C1为骨架构建乳腺特异性表达载体 p6.5hLF-EGFP。脂质体介导法转染山羊胎儿成纤维细胞,G418抗性筛选3-4周后,经PCR扩增和报告基因EGFP表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞系,为制备高效表达人乳铁蛋白的转基因山羊乳腺生物反应器提高可靠的核移植供体细胞。 相似文献
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猪(Sus scrofa)对饲料中植酸磷的消化利用效率很低,其粪便中排放大量未吸收的磷,对环境产生严重污染,在猪唾液腺中表达分泌植酸酶是解决猪粪磷污染的一条新途径.为了制备唾液腺特异表达植酸酶的新型减磷排放转基因猪,本研究构建了一条由猪腮腺分泌蛋白基因(parotid secretory protein,PSP)启动细菌源植酸酶基因appA(acid phosphoanhydride phosphohydrolase)表达的转基因载体,并利用体细胞核移植技术获得14头原代(F0)转基因克隆猪,经PCR鉴定,其中8头为阳性猪.PCR分析显示,appA基因在转基因猪的唾液腺组织特异表达,但在肾脏、肝脏、心脏、十二指肠等组织中不表达.营养代谢分析证明,转基因猪粪磷排放量比非转基因猪显著减少了16％(P＜0.05),而转基因猪对干物质和能量的表观消化率以及对Ca、P的消化率均高于野生型猪,但未达到显著水平.外源基因从F0转基因猪稳定遗传至F1,并且Southern blot分析显示,外源基因是以单拷贝形式整合至转基因猪基因组.F1转基因猪的appA表达模式与F0转基因猪相似,其只在唾液腺中特异表达,且以颌下腺表达最高,其次是腮腺和舌下腺,在肾脏、心脏、肝脏等组织不表达.本研究成功获得唾液腺特异表达植酸酶转基因猪,为培育新型减磷排放的环保转基因猪新品种提供了科学依据. 相似文献
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体细胞异种核移植是指将一个物种的体细胞移植到另一物种的去核卵母细胞中,移入的体细胞核在受体胞质中重编程并发育成新个体的实验方法。该方法为拯救濒危物种和获取灵长类胚胎干细胞提供了可能的途径。但这方面的研究目前还只获得初步的进展,核重编程不完全以及异种胚胎的囊胚率低仍是其面临的主要难点。本文从基因表达、表观重编程、线粒体异质性、核重塑和核移植体系优化等方面入手,介绍近年来哺乳动物体细胞异种核移植的研究进展,并探讨异种重构胚重编程所面临的关键问题和可能获得成功的方法。 相似文献
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体细胞克隆的效率一直较低,这可能与成熟前卵母细胞的质量有关。猪卵母细胞主要来源于屠宰场的废弃卵巢,这暗示,卵母细胞可能处于发情周期的各个阶段。因此,体细胞核转移之前有必要筛选优质卵母细胞。本研究旨在探讨亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A(TSA)对东北野猪(Sus scrofa ussuricus)核移植胚发育的影响。卵丘卵母细胞复合体经亮甲酚蓝(BCB)染色后分三组:BCB+组(胞质着色,葡萄糖-6-磷酸脱氧酶(G6PDH)活性低)、BCB-组(胞质未着色,G6PDH活性高)和对照组(不使用亮甲酚蓝染色)。卵母细胞体外成熟培养后,对卵母细胞进行核移植操作,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚使用50nmol/LTSA处理,未使用TSA处理的来源于BCB+卵母细胞的核移植胚作为对照组。结果表明,BCB+卵母细胞的直径显著大于BCB-组(P<0.05)。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的初次卵裂时间要早于BCB-组及对照组。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的囊胚形成率显著高于BCB-组及对照组(P<0.05)。且50nmol/LTSA处理可将来源于BCB+卵母细胞的核移植囊胚率提高到(29.6±2.8)%(P<0.05)。总之,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚发育能力较强,且50nmol/L的TSA可促进重构胚的体外发育。对卵母细胞进行BCB染色筛选并使用50nmol/L的TSA处理重构胚,可提高东北野猪核移植重构胚的发育能力,为通过体细胞克隆法保护东北野猪资源创造条件。 相似文献
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体细胞核移植技术目前主要局限性是需要显微操作仪以及相关设备,并且对技术人员也有较高要求。徒手切割法体细胞克隆(HM C)技术不需要显微操作,且对技术人员要求也不高,是一项手工化的核移植技术,对今后核移植技术的研究以及产业化的发展具有一定的推动作用。 相似文献
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深度学习在猪只饲养过程的应用研究进展 总被引：1，自引：1，他引：0
随着人工智能技术的兴起,深度学习技术发展迅猛,在图像及音频识别、自然语言处理、机器人技术、生物信息学、化学和金融等领域中应用广泛,也是目前发展精细畜牧业重要工具。养猪业是中国的重要农业产业,生猪的体况、行为及健康状况直接影响猪场的收入水平,通过深度学习技术可以快速、准确地了解猪只的相关信息并进行精确管理,提高猪只饲养效率及动物福利水平。该研究阐述了深度学习在目标猪只检测、猪只图像分割、猪只体况及异常监测、猪只行为识别上的应用现状,提出了深度学习技术在猪只饲养过程中的改进策略,以方便研究人员快速了解其研究进展。同时总结和分析了深度学习技术在猪只饲养过程中关于数据来源及数据集、应用范围、模型优化的不足与展望,提出应建立适用于猪只领域的公共数据集和统一的数据集标准,扩大深度学习的应用范围,优化DL模型以满足实际任务需求,将深度学习应用于猪场生产实践中。该研究旨为提高猪只福利化养殖和猪场经济效益提供依据,以推动深度学习在猪只饲养过程中应用的进一步发展。 相似文献
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提高PCR产物T-A克隆效率的研究 总被引：6，自引：0，他引：6
摘要：比较了3种T-A克隆法对于4个不同长度PCR产物的克隆效率。结果表明,对于较短的PCR产物（500 bp左右）,采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率;对于中等长度的PCR产物(3 000 bp左右),用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率;对于较长的PCR产物（6 000 bp左右）,用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率。 相似文献