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《动物医学进展》2015,(11)
旨在建立牛雄性生殖干细胞(mGSCs)-支持细胞(SCs)体外共培养体系,并比较不同密度SCs共培养mGSCs的效果。分离、培养mGSCs和SCs并鉴定,然后在密度不同的SCs上共培养mGSCs,观察细胞形态、统计mGSCs集落数、测定两种细胞特异基因的相对表达量。结果表明,培养的mGSCs具有与小鼠mGSCs相同的形态特征,AKP染色细胞克隆阳性,各培养体系均表达SCs和mGSCs特异基因SCF、OCT-4;低密度SCs(225个/cm2)培养mGSCs比中密度(1 300个/cm2)和高密度(5 600个/cm2)培养mGSCs效果好:mGSCs集落纯度、体积较大;mGSCs集落比例显著(P0.05)和极显著增高(P0.01);mGSCs特异基因表达量均极显著增高(P0.01)。说明建立睾丸干细胞体外共培养体系时,采用较低密度的支持细胞共培养可获得理想的睾丸生殖干细胞。 相似文献
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山羊PGCs用于分离与克隆类ES细胞 总被引：11，自引：1，他引：10
选择健康成年本地白山羊，自然发情，配种后44d取胎儿，以传统的原始生殖细胞（PGCs)分离与克隆的方法和PGCs与其胎儿生殖嵴周围组织细胞共同培养的方法获得类胚胎干细胞（类ES细胞），并对山羊类ES细胞在不同饲养层上进行培养。结果表明，采用传统方法与共培养的方法并添加细胞因子均能分离获得类ES细胞。分离获得的类ES细胞在同源（山羊）胎儿细胞饲养层上生长效果较好，可传4代或5代，而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上类ES细胞仅传3代。另外，共培养不添加细胞因子组仅获1个ES细胞集落，传代后丢失。 相似文献
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猪雄性生殖干细胞的分离培养及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在探索猪雄性生殖干细胞(mGSCs)体外分离、培养的适宜条件,建立猪雄性生殖干细胞体外培养体系。采用两步酶消化法对新生小猪睾丸生殖干细胞进行了体外分离和初步的培养鉴定,并利用层黏连蛋白和明胶的不同贴壁特性,比较2种差易贴壁分选方法的富集效果,并对传代后的干细胞培养1周后进行碱性磷酸酶染色鉴定,通过免疫荧光技术检测培养细胞是否表达干细胞标志蛋白OCT-4。试验结果表明,层黏连蛋白更适用于猪生殖干细胞的富集、培养,细胞分选效率及增殖生长明显优于采用明胶分选的方法。培养的mGSCs拥有与小鼠mGSCs相同的形态、增殖及表达特征。鉴定结果显示,生长细胞克隆碱性磷酸酶染色呈阳性,支持细胞碱性磷酸酶染色呈阴性;培养的生殖干细胞克隆表达转录蛋白OCT-4,而饲养层支持细胞OCT-4抗体染色则呈阴性。结果表明培养的干细胞克隆仍保持较好的干细胞活性,保持正常的自我复制和分化潜能,初步建立了生殖干细胞培养体系。 相似文献
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将本地槐山羊胎儿的原始生殖细胞(PGCs)与其生殖嵴周围组织细胞共同分离,经传代培养后获得了具有干细胞特征的山羊类ES细胞。结果表明高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基相比较,低糖DMEM更适宜于山羊类ES细胞的分离与克隆;类ES细胞在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上生长效果较好,可传4代或5代,而在小鼠成纤维细胞饲养层上,类ES细胞仅传3代;联合添加白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能显著提高山羊类ES细胞分离与克隆的效率;胎龄为30~45d的胎儿原代培养时可获得大量的细胞集落,克隆培养可传至5代,适合作山羊类ES细胞的分离培养。 相似文献
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某些因素对牛和小鼠类胚胎干细胞分离与培养的影响 总被引：4，自引：0，他引：4
以荷斯坦牛胚胎和小鼠胚胎为材料 ,研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离 ;在 ES细胞分离与克隆中 ,以 15 %～ 2 0 %犊牛血清为宜 ,在 DMEM(L)培养基中添加 0 .1μmol/LNa2 Se O3 0 .1mmol/Lβ-巯基乙醇 10 μg/L IGF 10 0 0 IU/m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;在TCM199、DMEM(高糖 )和 DMEM(低糖 ) 3种培养基中 ,低糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离 ;优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在 37℃用低浓度消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 ,ES细胞克隆效率最高。 相似文献
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由牛体外受精胚胎分离胚胎干细胞 总被引：2，自引：0，他引：2
以DMEM＋15％NBS＋0．1mmol/Lβ－巯基乙醇＋0．01μmol/L亚硒酸钠＋10μg/L LIF＋10μg/L IGF－1作为培养液，以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层，利用8日龄牛体外受精胚胎获得了传3代的牛类胚胎干细胞（类ES细胞）。通过体外分析试验，对所得类ES细胞的多能性进行了鉴定。结果在培养2d后，牛类ES细胞分化形成了类似于扩张囊胚的结构，悬浮于培养液中。 相似文献
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人胚胎原始生殖细胞的原代培养 总被引：2，自引：0，他引：2
从5－9周人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞（PGC），将其置于经过丝裂霉素C处理过的单层小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）饲养层上培养。结果，经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合小鼠胚胎干细胞（ES）的特性，表现为细胞核大，细胞排列紧密，界限不清，集落边缘可见分化的成纤维细胞等；将其接种于裸鼠皮下，经过29d生长，得到具有3个胚层组织结构的畸胎瘤。 相似文献
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试验在体外分离培养1月龄绵羊胚胎成纤维细胞（sheep embryonic fibroblast，SEF），经丝裂霉素C处理后探讨其作为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）体外培养饲养层的可行性。试验以SNL饲养层细胞为对照，人iPSC（hiPSC）为培养对象，通过形态学观察、碱性磷酸酶（AP）染色、以及实时荧光定量PCR和免疫细胞化学对hiPSC标志基因mRNA和蛋白表达的检测，比较了SEF细胞和SNL细胞作为干细胞饲养层的效果。结果表明，在试验期内，与SNL饲养层体外培养的hiPSC相似，SEF饲养层体外培养的hiPSC在形态上呈集落样生长，增殖速度快；AP染色呈蓝紫色，能够维持未分化状态；能正常表达多能性标志基因。两种饲养层细胞培养的hiPSC多能性标志基因c-Myc、Klf4、OCT4和SOX2 mRNA的表达以及OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-60蛋白的表达并无显著差异（P>0.05）。本研究结果初步表明SEF可作为体外培养iPSC的饲养层细胞，为进一步建立可表达促生长因子的基因修饰SEF细胞系奠定了基础。 相似文献
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旨在探索兔原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）体外分离培养的最佳条件,从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法。本研究首先通过两种不同的体外分离法（胰酶消化法、机械法）和3种不同的传代法（胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法）探索第14~18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式,另将培养液分为A、B、C、D 4组,以D组为对照组,探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响。其次,利用碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase staining,AKP）法对兔PGCs进行鉴定染色;实时荧光定量（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）检测转录因子Oct-4的表达。结果表明,机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍,而兔PGCs经不同的消化法传代发现,酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞（rabbit embryo fibroblast,REF）饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代。B组PGCs培养液（基础液+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）+2 ng·mL-1转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）+4 ng·mL-1碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）+10 ng·mL-1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF））所获得的集落数量最多,具有较好的集落形态,保持未分化的时间较长。AKP染色结果显示,PGCs集落呈红黑色; RT-PCR结果显示,体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4。结果显示,兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代,适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态。本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法,为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础。 相似文献
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鸡胚精原干细胞体外保存能力的研究 总被引：4，自引：1，他引：4
采用二酶3步法获取孵化第19 d的鸡胚精原干细胞（SSCs）,比较在快速冷冻条件下3种冷冻保护剂（DMSO、乙二醇、甘油）在3个浓度5%、10%、15%条件下对鸡胚精原干细胞的冷冻保存效果进行研究。结果显示：（1）当DMSO的浓度为5%、10%及15%时,复苏后细胞存活率分别为73.1%、88.6%和74.8%,三者差异显著（P〈0.05）;而10%DMSO保存精原干细胞的存活率、复苏后培养细胞生长和集落形成均显著高于其它2个浓度;当乙二醇浓度为5%、10%和15%时,复苏后细胞存活率分别为69.4%、83.1%和65.2%,三者差异显著（P〈0.05）;复苏后无论饲养层存在与否,SSCs均能增殖,但未有AKP阳性集落生成;当甘油浓度为5%、10%、15%时,复苏后细胞存活率均小于15%,三者差异不显著（P〉0.05）;复苏后细胞存活时间极短,仅存活12 h左右;（2）当在10%DMSO浓度条件,复苏后SSCs在有饲养细胞层的条件下,培养5 d形成集落,表明10%DMSO是鸡胚精原干细胞适宜的冷冻保护剂。 相似文献
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体外胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向生殖细胞分化可用于治疗不育症,同时也为揭示种系世代的分子机制提供最佳模型。试验旨在探讨视黄酸（retinoic acid,RA）诱导鸡胚胎干细胞（chicken embryonic stem cells,cESCs）向雄性生殖细胞（male germ cells,MGCs）分化的作用效果。利用胰蛋白酶消化法从新鲜种蛋X期鸡胚中分离胚胎干细胞,以鸡胚成纤维（chicken embryo fibroblast,CEF）细胞为滋养层,进行体外培养,利用形态法、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色和胚胎阶段特异性表面抗原（embryo specific surface antigen 1,SSEA-1）检测对获得的胚胎干细胞进行鉴定。结果表明,获得典型的呈巢状或岛状的cESCs克隆,细胞AKP染色呈蓝紫色,表明其具有较高的内源性AKP活性;SSEA-1鉴定结果呈阳性,显示cESCs克隆具有多能性。采用10-5 mol/L RA诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化,镜下观察细胞形态变化,分别于诱导第0、2、4、6、8、10天提取细胞总RNA,反转录成cDNA,用于实时荧光定量PCR检测生殖细胞标志基因的表达。结果表明,在此诱导过程中,作为胚胎干细胞标志基因Nanog、Sox2表达量持续显著下降,而生殖细胞特异性基因Dazl、Stra8、c-kit、integrin α6表达量呈持续上升趋势;免疫细胞化学检测可观察到特异基因相关蛋白的阳性克隆。本研究成功分离出cESCs,可体外培养并保持未分化状态及多能性。10-5 mol/L RA能够促进cESCs向雄性生殖细胞方向分化,可以引起生殖细胞相应基因的表达,为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供参考。 相似文献
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SONG Lianjie CUI Yingying ZHAO Yiping BAI Dongyi REN Xiujuan TE Rigele DUGARJAVIIN Manglai LI Bei 《中国畜牧兽医》2007,47(9):2751-2758
To study a simple and rapid separation of testis Sertoli cells in Mongolian horses and ensure their activity,the testis tissue of two-year-old Mongolian horses was mechanically isolated under a low temperature environment in this experiment,and 1-3 g of testis tissue was chopped,the free red blood cells and interstitial cells were removed by gravity precipitation method.0.1% collagenase Ⅳ and 0.25% trypsin-EDTA were used for tissue digestion, and cells were cultured in medium containing 10% fetal bovine serum.After inoculation,the purified Sertoli cells were isolated and purified by differential sticking method,and the impurity cells were removed by Tris-HCl infiltration method,and were identified by alkaline phosphatase (AKP) staining,HE staining and Real-time quantitative PCR.The results showed that most of the cells began to adhere to the wall after culture 24 h,and the shape of the cells was oval.After culture 48 h,the cytoplasm increased and the refraction became stronger.After culture 3-4 d,the cytoplasm of the cells expanded into tight junction.At this time,the cells were triangular with obvious nucleoli.After culture 6-7 d,the cells entered the stable phase.Real-time quantitative PCR results showed that the expression of GATA4 and GDNF genes were extremely significantly expressed in cultured cells (P<0.01).AKP staining supported the negative expression in Sertoli cells,indicating that the isolated cultured cells were indeed Sertoli cells.In this experiment,tissue was treated by mechanical separation and two-step enzyme digestion,and testicular support cells were obtained quickly and efficiently,the method of culturing Sertoli cells in Mongolian horses testis in vitro was successfully constructed. 相似文献
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为研究一种简单快速分离蒙古马睾丸支持细胞并保证其活性的基本方法,本试验采集2岁蒙古马睾丸组织于低温环境下进行机械分离,将1~3 g睾丸组织剪碎,采用重力沉淀法去除游离的红细胞和间质细胞;使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶+EDTA逐步进行组织消化,并用含有10%胎牛血清的培养基进行细胞培养;在接种后采用差异贴壁法分离纯化支持细胞,使用Tris-HCl低渗法去除杂质细胞,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、HE染色、实时荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示,支持细胞贴壁性能较强,培养24 h后大多数细胞开始贴壁,细胞形状呈椭圆形;培养48 h后胞质增多,折光性变强;培养3~4 d细胞胞质展开紧密连接,此时细胞呈三角形,有明显的核仁,培养6~7 d细胞生长状态进入稳定期。实时荧光定量PCR结果显示,GATA4和GDNF基因在培养细胞中极显著表达（P<0.01）,AKP染色支持细胞呈阴性表达,表明分离培养的细胞确为支持细胞。本试验使用机械分离法与两步酶消化法处理组织,可快速高效地获得睾丸支持细胞,成功构建了蒙古马睾丸支持细胞体外培养方法。 相似文献
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鸡胚胎干细胞的分离和培养 总被引：2，自引：0，他引：2
实验从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μL/mL非必需氨基酸以及含1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)和5ng/mL干细胞生长因子(SCF)的高糖DMEM对细胞进行培养和传代,可以获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞(ES)。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。同时通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。 相似文献