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转基因水稻B2A68中抗虫蛋白Cry2Aa的表达特征和抗性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)基因的高效表达和稳定遗传对抗虫转基因水稻(Oryza sativa)的培育和商业化生产至关重要。转基因水稻B2A68是通过农杆菌介导法把双丙氨酰磷抗性基因(biplaphos resistance gene,Bar)和Bt杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal proteins gene)Cry2Aa同时转入到恢复系D68中,培育出的抗除草剂、抗螟虫的两系早稻恢复系。本研究运用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测法研究了B2A68纯杂合基因型、不同组织及不同发育时期叶片中Cry2Aa蛋白的时空表达特征,并结合室内生测实验,揭示抗虫蛋白的表达水平、时期、部位与抗虫性的相关性。研究表明,转基因抗虫水稻B2A68纯合植株叶片中Cry2Aa蛋白表达量极显著高于杂合植株。乳熟期各器官中Cry2Aa蛋白含量为:叶片颖壳和脱壳籽粒茎秆和叶鞘(P0.05);腊熟期各器官中Cry2Aa蛋白含量为:叶片脱壳籽粒茎秆和颖壳(P0.05),但脱壳籽粒和叶鞘之间、叶鞘和茎秆之间、茎秆和颖壳之间的Cry2Aa蛋白含量差异不显著。从秧苗期到腊熟期的叶片中Cry2Aa蛋白含量表现为先升后降再升高的波动,且T_3、T_4两代波动趋势一致。二化螟幼虫(Chilo suppressalis)死亡率与乳熟期各器官中的Cry2Aa蛋白含量高度相关(r=0.837),稻纵卷叶螟幼虫(Cnaphalocrocis medinali)死亡率与各发育时期叶片中的Cry2Aa蛋白含量高度相关(r=0.988)。Cry2Aa蛋白含量较低的杂合植株叶片对稻纵卷叶螟幼虫的全部致死时间稍长,但不超过5 d。本研究结果对田间害虫的防治以及转基因水稻的育种都具有参考价值。 相似文献
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椰心叶甲是近年来传入我国的危险性有害生物。1994年,我国内陆将椰心叶甲列为禁止入境的二类植物检疫危险性害虫。目前椰心叶甲在我国海南省、广东省、台湾省和香港地区危害严重并有蔓延趋势,严重危害了椰子、槟榔等棕榈科植物。针对椰心叶甲的危害特征,在实际防治应用中,化学防治,物理防治等方法不能起到很好的效果,生物防治是比较重要的防治方法。本文综述了对于椰心叶甲生物防治常用的几种防治方法：释放寄生蜂、病源微生物和生物农药等。椰心叶甲的生物学防治措施,关键是开发新的防治措施和提高现有方法的防治技术,达到持续有效控制。 相似文献
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苏云金杆菌Cry2Ab可溶蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
苏云金杆菌Cry2Ab蛋白是一类对鳞翅目昆虫有特异性毒性作用的毒素蛋白,已广泛应用于针对鳞翅目害虫的防治之中。依据苏云金杆菌cry2Ab基因序列设计一对全长引物,从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)WB9菌株总DNA中克隆出cry2Ab基因全序列,构建Cry2Ab-PK表达载体,将获得的Cry2Ab-PK阳性克隆进行原核诱导表达,获得约90kD的Cry2Ab-GST融合蛋白,经批量纯化并切除GST标签后获得可溶Cry2Ab蛋白,约65kD。利用纯化Cry2Ab可溶蛋白免疫新西兰雄性大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备Cry2Ab兔源多克隆抗血清,通过间接ELISA法测定Cry2Ab抗血清效价超过1:150000。Western blot测定结果表明,制备的Cry2Ab兔源抗血清能特异性识别Cry2Aa及Cry2Ab抗原蛋白,不能识别Cry1Ab及Cry3Aa抗原蛋白。研究结果对深入研究Cry2A毒素蛋白作用机理及毒素与受体间互作关系提供了技术支持。 相似文献
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由于Bt Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac晶体蛋白之间具有很高的同源性(82%~90%),采用常规的单抗制备方法很难制取特异性强的Bt Cry1Ab单抗,为了制备抗Bt Cry1Ab蛋白的特异性单克隆抗体(MAB),本研究从NCBI获得了Bt Cry1Ab蛋白的氨基酸序列,根据ANTHEPORT和DNAStar软件对其抗原性、亲水性和表位性分析结果选定BtCry1Ab特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞22株。通过ELISA试验从中筛选出与Bt Cry1Ab天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株(3A10)。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1型;轻链属κ型;杂交瘤细胞株染色体数目为89~108条;用其制作的腹水对Bt Cry1Ab合成肽的反应效价为1∶1×107;对Bt Cry1Ab天然蛋白的反应效价为1∶1×104;纯化后的抗体对Bt Cry1Ab合成肽的效价为1∶1×108;对Bt Cry1Ab天然蛋白的效价为1∶2×104。抗体的相对亲和力为0.5μg/mL,对Bt Cry1Ab蛋白的最低可检测值为10ng/mL。ELISA结果显示,3A10杂交瘤细胞株所分泌的MAB能特异性识别合成肽和Bt Cry1Ab蛋白,而对同源的Cry1Ac和Cry1Aa蛋白无交叉反应;本研究所制备的Bt Cry1Ab单克隆抗体能够对常规棉和抗虫棉(Gossypium hirsutumL.)进行有效的区分,并且能特异性的识别其中的Bt Cry1Ab蛋白。 相似文献
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用不同浓度的NaCl溶液分别处理番茄(Lycopersicon esculentum cv．UC-82)幼苗，研究分别处理12、24和48h后乙烯信号转导途径中编码转录因子基因的表达变化。结果表明，不同浓度的NaCl溶液处理番茄幼苗12h能明显促进Le-EIL1基因的表达；0．08mol／L NaCl溶液处理12和24h都能促进Le-E1L2基因的表达；用0．04和0．08mol／L NaCl处理12h和24h后，Le-EIL3基因表达都得到增强。用0．04和0．08mol／L NaCl溶液处理番茄幼苗12h能显著地促进Le-ERF1基因的表达；用3种浓度的NaCl溶液0．04，0．08和0．16mol／L处理番茄幼苗12h后均能明显的促进Le-ERF2基因的表达；用不同浓度的NaCl溶液分别处理番茄幼苗Pti4基因的表达变化不大。这些结果说明Le-EILs和Le-ERFs家族成员基因在不同浓度NaCl溶液和不同处理时间条件下表现不同的表达模式。 相似文献
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营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein,Vip)是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为Vip1、Vip2和Vip3三种,以Vip3的研究最为深入。Vip3A对鳞翅目(Lepidoptera)害虫具有广谱杀虫活性,具有重要研究意义。本研究以Bt WB5菌株总DNA为模板,采用PCR方法扩增vip3Aa(Gen Bank登录号:AAM22456)全长,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行酶切验证和序列测定。将vip3Aa基因片段与经同样酶切的表达载体p Czn1连接,构建重组表达载体p Czn1-vip3Aa,转入大肠杆菌Arctic ExpressTM(DE3),异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在沉淀和上清中均有约88 k D VIP3Aa蛋白质表达产物;采用Ni亲和树脂对上清中的VIP3Aa融合表达蛋白进行了纯化,获得了纯化蛋白。本研究成功亚克隆了vip3Aa基因,并表达纯化了VIP3Aa蛋白,为后续研究VIP3Aa蛋白在昆虫中肠的作用受体提供了基础资料。 相似文献
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双价苏云金芽孢杆菌cry基因载体构建及其在大肠杆菌中表达杀虫活性 总被引：2，自引：0，他引：2
研究和利用不同苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫蛋白之间的增效作用是构建高效遗传工程虫剂，预防和延缓害虫抗性的重要途径。BtCry1Ab,Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对重要的鳞翅目农业害虫具有主毒力，质粒pHT-BSK含有能在大肠杆菌（Echerichia coli)－枯草芽孢杆菌（B.subtilis)有效表达的生物安全性标记基因卡那霉素抗性基因。将含Btcry1A,cry1Ac和cry2Aa全长基因的Bam HI/PstI,Bam H I/Xho I和Sma I(Bam H I)HindⅢDNA片段与pHT-BSK的应酶切产物连接，获得了单价cry/km^r组合的重组质粒pBlue-1Ab-km^r,pBlue-1Ab和pHT-2Aa;cry1Ab,cry1Ac DNA片段与pHT-2Aa相应酶切产物相连接获得了Bt双价基因／km^r组合重组质粒pBlue-crylAb-km^r-2Aa和pBlue-cry1Ac-km^4-2Aa，重组质粒中所有cry基因与km^r均形成特异的Bam H I片段。限制酶切电泳分析和特异PCR扩增证实了重组质粒的准确连接。含有重组质粒的大肠杆菌显示了对小菜蛾（Plutella xylostella）和玉米暝（Ostrinia furnacalis)的杀虫活性，对小菜蛾双价基因毒力高于单价基因，但对玉米螟它们之间没有明显差异。研究为进一步阐明Bt cry 2Aa与cry1Ab和cry 1Ac之间在不同微生物细胞中的共表达及其表达产物之间的相互作用和构建双价基因杀虫工程菌株创造了条件。 相似文献
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为研究假蒟对螺旋粉虱的作用效果及对体内酶活力的影响,在实验室采用叶片浸渍法测定了不同浓度的假蒟石油醚萃取物对螺旋粉虱成虫、若虫和蛹的生物活性,并用生化方法测定了成虫体内几种代谢酶的活性变化。结果显示,假蒟石油醚萃取物对螺旋粉虱具有良好的生物活性,且随着处理时间的延长,活性增强,其活性大小为成虫若虫蛹。处理168 h时,假蒟石油醚萃取物对螺旋粉虱若虫的LC50值(0.932 mg.mL 1)仅为处理24 h时LC50值(2.207 mg.mL 1)的42.23%。处理72 h时,假蒟石油醚萃取物对螺旋粉虱成虫和若虫的LC50值(0.430 mg.mL 1和1.303 mg.mL 1)分别为蛹(1.894 mg.mL 1)的22.70%和68.79%。经假蒟石油醚萃取物处理24 h后,螺旋粉虱成虫体内的乙酰胆碱酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)等代谢酶均受到一定程度的抑制。10 mg.mL 1的假蒟石油醚萃取物对3种酶的抑制率分别为82.53%、82.79%、52.26%,但低浓度的假蒟石油醚萃取物对螺旋粉虱成虫CarE、GSTs两种酶的活性反而有诱导现象,其中对GSTs诱导效应较为明显。由此表明,假蒟石油醚萃取物对螺旋粉虱有明显的毒杀作用。 相似文献
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苏云金芽胞杆菌新型vip3Aa基因的克隆、表达与活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了发掘新型vip3基因,本研究采用PCR和高分辨熔解曲线的方法对72株菌株中vip3基因进行了鉴定和分析,结果表明,有18株菌呈阳性,分别含有vip3Aa、vip3Af和vip3Ba共3类vip3基因。根据已知vip3基因的全长序列设计引物,以菌株T03B001(B.thuringiensis subsp.sumiyoshiensis)的总DNA为模板扩增出长为2.37kb的全长基因,插入表达载体pEB,转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)菌株,在低温条件下经IPTG诱导后,表达88kD的蛋白,该蛋白由789个氨基酸组成,与已知的Vip3Aa氨基酸一致性为96%,已被国际Bt命名委员会正式命名为Vip3Aa39,GenBank登录号为HMI17631。Vip3Aa39蛋白与本实验室此前获得的Vip3Aa11蛋白进行比较,发现两者存在39个氨基酸的差异。两种蛋白的表达产物采用饲喂法分别对小地老虎(Agrotis ipsilon)、小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua... 相似文献
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Okumura S Saitoh H Ishikawa T Wasano N Yamashita S Kusumoto K Akao T Mizuki E Ohba M Inouye K 《Journal of agricultural and food chemistry》2005,53(16):6313-6318
Parasporal inclusion proteins produced by Bacillus thuringiensis strain A1470 exhibit strong cytotoxicity against human leukemic T cells when activated by protease treatment. One of the cytotoxic proteins was separated by anion exchange chromatography and gel filtration chromatography and designated Cry45Aa. Its gene was then expressed in recombinant Escherichia coli, in which the Cry45Aa precursor was accumulated in an inclusion body. It was solubilized in sodium carbonate buffer and processed with proteinase K, and cytotoxic activities of the protein against various mammalian cell lines were evaluated using the 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide assay. The protein exhibited high cytotoxic activity against CACO-2, Sawano, MOLT-4, TCS, and HL60 cells and moderate activity against U-937 DE-4, PC12, and HepG2 cells. On the other hand, the EC50 values against Jurkat, K562, HeLa, A549, Vero, COS-7, NIH3T3, CHO, and four normal tissue cells (human primary hepatocyte cells, UtSMC, MRC-5, and normal T cells) were >2 microg/mL. 相似文献
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苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性 总被引：9，自引：1，他引：9
B-8-G和Ly30是我国自行分离的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株,经PCR-RFLP鉴定均含有cry2Aa基因.根据cry2Aa全长基因序列设计特异引物,以B-8-G总DNA为模板扩增其中的cry2Aa全长基因,与大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b相连接,获得含有cry2Aa全长基因的重组质粒pET2Aa,该基因在大肠杆菌BL21菌株能够正常表达65 kD蛋白.通过构建Ly30总DNA文库方法从中筛选获得cry2Aa基因,将其连接至Bt-E.coli穿梭表达载体pHT315上,转化Bt无晶体突变株HD-73中,该基因能正常表达65 kD蛋白,并形成立方体状晶体.这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为cry2Aa9和cry2Aa10.杀虫生物活性测定结果表明cry2Aa基因表达产物对黄胫小车蝗（Oedaleusinfernlis）、尖音库蚊（Culex pipiens）、黑翅伊蚊（Aedes melanopterus）、水稻二化螟（Chilo suppressalis）和小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫均具有显著的毒杀作用.首次报道cry2Aa10基因表达蛋白对蝗虫、库蚊具有杀虫活性.这些基因的获得,将为高效工程菌和抗虫转基因植物的研制提供了新的基因资源. 相似文献
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陆秀君 《农业生物技术学报》2007,15(5)
从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的Bt LS1菌株。分子检测菌株中存在营养期杀虫蛋白基因，进行了该基因的克隆表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段；克隆序列分析证实为新Vip3A基因，命名为Vip3A-LS1，GenBank登录号DQ016968，Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体，SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达；生物测定表明，胞内可溶性蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2µg/g。 相似文献
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植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用 总被引：1，自引：0，他引：1
以含有植物激活蛋白(Activator protein)基因ap36的质粒pMYE为摸板,设计一对特异引物,通过PCR反应扩增出激活蛋白基因开放读码框序列,使用XbaI和SphI双切PCR产物,插入到用这两酶双切的pBMB982-304质粒slh motif的下游,构建重组表达质粒pBMB0588,转化苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171。结果表明,目标蛋白以融合蛋白的形式成功表达。为探讨表达植物激活蛋白的重组菌是否能够诱导植物获得抗性,用重组菌在28℃培养24小时发酵液原液处理番茄幼苗和土豆片。结果显示,发酵液处理90min后,番茄叶片过氧化物酶(POD)和脯氨酸含量较对照分别提高了57.14%和131.59%;4d后苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量较对照也有所提高;经重组菌发酵液处理的马铃薯片,对马铃薯软腐病表现出很强的抗病性。 相似文献
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宋萍 《农业生物技术学报》2008,16(3)
苏云金芽孢杆菌WZ-9是本室从河北省土壤中分离的对马铃薯瓢虫的幼虫有特异杀虫活性的新菌株，本文对该菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等方面进行了研究。结果表明该菌株可产生菱形伴孢晶体，SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130kDa，生长周期是24h，随菌株的生长培养基pH值发生变化；生物活性测定表明该菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72h校正死亡率达100%，LC50为2.95×107细胞/mL；基因型鉴定表明含有cry7基因，获得了一条总长为3781bp基因序列，其中包含了一个3414 bp的开放读码框，其编码的蛋白由1138个氨基酸残基组成，与Cry7Ab2具有99.65%的序列同源性，存在4个氨基酸差异，亲缘关系最近，该蛋白被Bt 杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3( 登录号为BI 1015188) 。 相似文献
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Volatile extracts were isolated from dried medicinal plants [Angelica tenuissimae roots (AT, Angelica tenuissima Nakai), peppermint leaves (PL, Mentha arvensis L.), pine needles (PN, Pinus sylvestris L.), and sweet flag leaves (SF, Acorus gramineus Rhizoma)] using steam distillation under reduced pressure, followed by continuous liquid-liquid extraction (DRP-LLE). The extracts were then analyzed by gas chromatography (GC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The major volatile constituents of AT, PL, PN, and SF were 3-butylidene-4,5-dihydrophthalide (32 mg/g), menthol (18 mg/g), thunbergol (2.1 mg/g), and cis-asarone (37 mg/g), respectively. The inhibitory activity (%) of the extracts against hexanal oxidation ranged from 33 to 98% at a level of 50 microg/mL. Among the volatile extracts, PL and PN increased cell viabilities by 10 and 24%, respectively, at a dose of 1 microg/mL, compared to that of H2O2-treated brain neuroblastoma cells, SK-N-SH. However, a 20% reduction in the malonaldehyde level, an index for lipid peroxidation, was observed at only 1 microg/mL concentration of PN. 相似文献
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本研究利用Real-time PCR方法,分析利用哈维氏弧菌和副溶血弧菌混合菌液攻毒12 h、24 h和48 h后,大黄鱼脾脏组织中PcQM基因表达的变化情况。结果表明,攻毒12 h后脾脏组织中大黄鱼PcQM基因表达量显著降低0.031±0.006,且差异极显著（p〈0.01）;攻毒24 h后,表达量显著增加16.240±2.822倍,且差异显著（p〈0.05）;攻毒48 h后脾脏组织中大黄鱼PcQM基因表达量显著降低0.115±0.025（p〈0.01）。初步推测,PcQM基因在大黄鱼免疫系统中起着重要的调控作用。本研究构建了PET28a（＋）/PcQM表达载体,进行体外表达。用Western-blotting分析,证实有一条约为25 kD的蛋白条带,表明PcQM蛋白体外表达成功。本研究为进一步研究PcQM蛋白免疫调节功能奠定了基础。 相似文献
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Chen CN Liang CM Lai JR Tsai YJ Tsay JS Lin JK 《Journal of agricultural and food chemistry》2003,51(25):7495-7503
Theanine, caffeine, and catechins in fresh tea leaves and oolong tea were determined by using capillary electrophoresis (CE). CE separated these tea polyphenols from three other tea ingredients, namely, caffeine, theophylline, and theanine, within 8 min. The young leaves (apical bud and the two youngest leaves) were found to be richer in caffeine, (-)-epigallocatechin gallate (EGCg), and (-)-epicatechin gallate (ECg) than old leaves (from 5th to 7th leaves). On the other hand, the old leaves (from 8th to 10th leaves) contained higher levels of theanine, (-)-epigallocatechin (EGC), and (-)-epicatechin (EC). Results from a comparison of fresh young tea and oolong tea compositions indicated oolong tea contained more theanine and catechins than fresh young tea. Furthermore, it was found that the levels of theanine, EGC, and EGCg in young leaves rose markedly with the withering process. Caffeine did not markedly change. However, fully or partially fermented teas (oolong tea or pauchong tea) have a common initial step in the withering process. Fresh tea leaves or oolong tea extract (0.1%, w/v) markedly inhibited neurosphere adhesion, cell migration, and neurite outgrowth in rat neurospheres. Theanine (348 micrograms/mL) and caffeine at high concentration (50 micrograms/mL) did not inhibit neurosphere adhesion or migration activities, but EGCg at 20 micrograms/mL effectively inhibited neurosphere adhesion for 24 h. These results indicated that EGCg might affect neural stem cell survival or differentiation. 相似文献