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大肠杆菌K88ac—STl—LTB三价基因工程菌株的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用PCR技术，从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了合K88ac—ST1—LTB融合基因表达载体的重组菌株BL2l(DE3)(pXKST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实，构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac—ST1-LTB融合基因，是基因序列和阅读框架均正确。免疫试验结果表明，K88ac—ST1—LTB融合蛋白能够诱发机体产生抗体，该抗体具有中和天然STl肠毒素毒性的作用。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac，ST^ ，LT^ )的攻击。由此表明，构建的工程菌株BL2l(DE3)(pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株。 相似文献
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表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究 总被引：2，自引：0，他引：2
已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。 相似文献
3.
产肠毒素性大肠杆菌所致的仔猪黄、白痢在我国广大养殖地区流行十分广泛,发病率和死亡率都很高,即便是病愈存活的仔猪,其生长发育和生产性能指标也会受到严重影响,给养猪业造成了极其严重的经济损失.我们利用基因工程技术将大肠杆菌菌毛K88ac抗原基因与肠毒素ST1和LTB基因融合在一起,获得了高效表达K88ac-ST1-LTB融合蛋白的基因工程菌株,所表达的产物,既保持了K88ac菌毛抗原和LTB肠毒素良好的免疫原性,又赋予了ST1的免疫原性,同时在构建过程中,通过定点突变使ST1丧失了原有的生物毒性,这样就可以从菌毛和肠毒素两种途径来达到免疫预防的目的[6].本试验对用于生产仔猪大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活苗的基因工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)菌种的使用限定代次及保存条件进行了系统的研究,为研制仔猪大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程灭活苗提供了重要参数. 相似文献
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大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合基因表达条件的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含K88ac-ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下K88ac-ST1-LTB融合基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,同时以IPTG为诱导剂诱导K88ac-ST1-LTB融合基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果:培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度1.0 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间3 h,此时K88ac-ST1-LTB融合蛋白表达量为35.2%。本文实现了K88ac-ST1-LTB融合基因的高效表达,并为大肠杆菌肠毒素三价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。 相似文献
5.
利用PCR技术，从A型产气英膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出a毒素（CPA）基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含CPA—LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实，构建的重组质粒pET—CPA含有CPA—LTB融合基因，其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS—PAGE分析，重组菌株表达的CPA—LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）经IPTG诱导后，融合蛋白CPA—LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5％。 相似文献
6.
为了有效预防肠毒素性大肠杆菌引起的犊牛和羔羊腹泻,利用基因工程技术构建了融合基因K99-ST1及其原核表达载体,并时融合蛋白进行了初步免疫原性分析.结果显示,将PCR获得的K99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段借助pUCm-T载体,成功构建重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ+SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET30a中,成功构建表达载体pET-K99-ST1;将该表达载体转入表达菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到大小约31 000的蛋白;Western blotting显示,融合蛋白可以特异的与K99阳性血清反应;将BL21(DE3,pET-K99-ST1)诱导表达后免疫兔,ELISA检测K99抗体水平较高,乳鼠灌胃试验显示该菌株免疫后产生ST1抗体.这表明本试验已成功构建大肠杆菌K99-ST1双价基因工程菌株BL21(DE3,pET-K99-ST1),该菌株具有良好的免疫原性,为大肠杆菌K99-ST1双价基因工程疫苗开发奠定了基础. 相似文献
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采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(ST Ⅰ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将ST Ⅰ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达栽体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别. 相似文献
8.
本研究为构建表达产肠毒素性大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,从质粒pET-K88ac-STⅡ中扩增编码融合蛋白K88ac-STⅡ的基因并插入线性T载体pBS-T中,经酶切、PCR、测序鉴定正确后,再用限制性内切酶切下,插入含有asd基因的表达载体pYA3334,构建pYA-K88ac-STⅡ重组质粒。重组质粒鉴定正确后电穿孔转入缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸p-半醛脱氢酶基因（Aasd）的鼠伤寒沙门菌（X4550）中,以获得重组菌株X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。结果显示该无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖,口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。通过本试验成功构建了表达K88ac-STⅡ融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。 相似文献
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表达无毒性大肠杆菌ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
利用基因突变技术，将形成ST1分子内二硫键的半胱氨酸碱基进行突变，使ST1失去本身毒性，进而将其与含有LTB基因的pET-28b( )连接，转化至受体菌BL21(DE3)，重组菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)经IPTG诱导后，其表达产物免疫的小鼠能够抵抗大肠杆菌强毒菌的攻击并且消除了ST1的毒性，表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)可作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选菌株。 相似文献
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产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STⅡ融合基因的构建与表达研究 总被引：6，自引：0，他引：6
PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,FTEC)LTB、STI、STⅡ基因，将LTB、STI、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LTB－STⅡ－STI的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。pBST在宿主菌BL21（DE3）RIL中的表达产物经SDS－PAGE初步分析，显示重组融合蛋白的分子量约为40kD，其表达量约占菌体总蛋白的46％。 相似文献