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鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。 相似文献
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为了获得高纯度的犬瘟热病毒5＇端H蛋白,本研究通过参考GenBank中发表的CDVH蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从犬瘟热病毒疫苗毒株CDV3和野毒株CDVSD株提取总RNA,经FIT—PCR扩增得到388bp的基因片段,将目的基因与原核表达载体pET28a（＋）连接构建了pET28a—CDV3-H5和pET28a—CDVSD-H5重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。重组表达载体pET28a—CDVSD—H5在大肠杆菌中成功的表达,目的重组蛋白为22kD,而pET28a—CDV3-H5未能表达。经Ni—NTA洗脱纯化后,rCDVSD—H5蛋白被成功纯化。Western blot分析表叫,表达产物能够被犬抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。为血清学诊断方法的建立和基因工程疫苗的研究奠定基础。 相似文献
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根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列设计2对引物,通过PCR扩增得到了PRRSV M基因的全长片段和N-末端截短67个氨基酸序列的MNd67基因片段,分别将这些片段插入到表达质粒pET-28a(+)的多克隆位点上构建重组表达质粒,PCR、酶切及测序鉴定表明,成功构建了2种重组表达质粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖诱导其表达,SDS-PAGE电泳分析表明,E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV MNd67成功表达分子质量为14ku的重组蛋白,而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未见明显的表达蛋白。试验结果表明已成功表达截短的PRRSV M蛋白,可为PRRSV诊断抗原和疫苗研究奠定基础。 相似文献
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CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测 总被引：2，自引：1，他引：2
采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a( )中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a( )-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。 相似文献
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《甘肃农业大学学报》2020,(3):71-77
【目的】探究苦荞蔗糖合酶结构与功能的关系,构建表达载体以实现SuSy基因在大肠杆菌中的表达,并经亲和层析纯化后得到重组SuSy蛋白,为进一步研究该酶的结构和功能奠定基础.【方法】以苦荞(Fagopyrum tataricum)cDNA文库中克隆得到的蔗糖合酶基因重组质粒为模板,PCR扩增得到SuSy编码序列,将其与原核生物表达载体pET28a相连接构建了重组表达载体pET28a-SuSy,经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切及测序鉴定正确后将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达SuSy重组蛋白,并对其诱导表达条件进行优化.【结果】在37℃、1.2 mmol/L IPTG诱导10 h时,SuSy蛋白表达量最高,分子量大小约为53.4 ku,超声破碎后经SDS-PAGE检测到该蛋白以包涵体形式存在.【结论】利用Co~(2+)亲和柱层析纯化和His-tag鉴定得到了高纯度的重组SuSy蛋白,为该酶结构与功能的研究及多克隆抗体制备奠定了基础. 相似文献
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犬瘟热病毒水貂株H与F蛋白基因原核表达重组质粒的构建及表达 总被引：1，自引：1，他引：0
将克隆质粒pMD-18T-H和pMD-18T-F分别进行双酶切,获得纯化的H基因和F基因,在T4DNA连接酶的作用下,亚克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得原核重组质粒pET28a-H和pET28a-F.将原核重组质粒转化大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta2(DE3)中进行表达,SDS-PAGE结果显示H基因和F基因分别表达相对分子质量约为31 400和38 200的融合蛋白,Western-blot检测结果显示,表达蛋白均可与CDV标准阳性血清呈阳性反应,表明原核表达的CDV H蛋白和F蛋白在反应原性上具有与天然H蛋白和F蛋白同样的特性,可作为CDV诊断用抗原,为CDV的免疫预防研究奠定基础. 相似文献
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为获得具有抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)3D蛋白N端T细胞表位的重组表达蛋白,根据FMDV3D蛋白前115位氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET-28a中,构建原核表达质粒pET28a-115,并将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-bolt鉴定,结果显示,在16kD处有一条明显的蛋白表达条带。对表达产物进行可溶性分析,结果表达蛋白50%为可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得了较高浓度和纯度的目的蛋白。研究结果表明,含FMDV 3D蛋白前115位氨基酸的重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,并具有较好的抗原活性,为开发口蹄疫诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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[目的]通过拼接完成对SARS S蛋白的上下游序列S1和S2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的S1和S2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成SARS香港株S蛋白上下游2个片段S1和S2;构建S1和S2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-S1和pET28a-S2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到S1和S2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续SARS疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。 相似文献
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猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础. 相似文献
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OmpT(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌OmpT降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗OmpT蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954 bp的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-OmpT。经IPTG诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36 kDa且具有生物活性的OmpT蛋白。生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。 相似文献
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【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。 相似文献
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采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白（GZFP）的融合蛋白．以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b（＋）中,转化宿主菌BL21（DE3）,成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET—GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达． 相似文献
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产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的克隆与表达 总被引：1，自引：1，他引：0
应用PCR方法从产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)中扩增出不含信号肽序列的F5菌毛抗原基因片段,克隆测序后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,转化工程菌BL21,经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,重组蛋白在BL21中得到表达并与F5菌毛单因子血清发生明显反应。 相似文献
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ZHAO Pan TANG Shun-ming LIU Tingx LIU Ting QIN Guang-xing GUO Xi-j ie 《中国农业科学(英文版)》2010,9(12):1821-1828
The gene of the non-structure protein 2 （NS2） was cloned by PCR from the genome ofBombyx mori densovirus Zhenjiang strain （BmDNV-Z）, inserted into prokaryotic expression vector pET28a to construct recombinant plasmid pET28a-NS2 and then expressed in bacteria Escherichia coli BL21 （DE3）. The expressed recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. Then, the recombinant protein was purified by Ni-NTA column, renatured and tested for enzyme activities. The purified NS2 protein exhibited a helicase activity unwinding double-stranded DNA substrates into single-strand primers, and higher unwinding activity to polarity substrate. Similarly, the purified NS2 protein possessed an ATPase activity and its enzyme activity was 0.276 μmol gg^-1 h^-1 in this study. The results indicated that the non- structure protein which encoded by the gene of BmDNV-Z NS2 possesses the biological activities of helicase and ATPase, and the helicase prefers to polarity substrates. Based on these results, it is speculated that the gene of BmDNV-Z NS2 plays an important role in the viral DNA replication. 相似文献
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根据NCBI上果胶裂解酶(PL)基因在黑曲霉基因组上的分布特点设计特异引物,通过重组PCR扩增出黑曲霉编码PL的结构基因。将PL基因连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上,得到重组质粒pET-28a-PL,转化大肠杆菌(E.coli)BL21后,用IPTG进行诱导表达。结果表明,PL基因片段序列全长1 431bp,与已知PL基因(XM_001397206.2)核苷酸和氨基酸序列同源性均为99%。表达产物经12%SDS-PAGE电泳,得到了一条大小约为50kD的条带,与预期分子量相符,证明真菌PL基因在E.coli BL21中可以有效表达。 相似文献
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磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础. 相似文献
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萝卜抗菌肽基因AFP的克隆及其在大肠杆菌中的诱导表达 总被引：5，自引：2，他引：5
试验采用RT-PCR方法,从萝卜叶子中克隆得到抗菌肽基因AFP(antifungal protein)。该基因全长240个碱基,79个氨基酸。经测序证明克隆所得基因与GeneBank中发表的原序列一致。将此抗菌肽基因克隆到E. coli表达载体pET28a,在IPTG的诱导下表达出含有AFP的11.99 ODD,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达。 相似文献
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参照Torque teno mini virus(TTMV)2型的ORF1基因序列,设计一对特异性引物,成功扩增出ORF1基因,并将其转化至表达载体pET-28a中,成功构建原核表达质粒pET28a-ORF1,并导入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.SDS-PAGE分析结果表明,ORF1基因在大肠杆菌中获... 相似文献