共查询到20条相似文献，搜索用时 250 毫秒
1.
[目的]通过设计特异性引物与荧光探针,建立马达加斯加龙树（Didierea madagascariensis）实时荧光定量PCR鉴定方法。[方法]提取26份龙树科植物基因组,并用内源基因检测DNA质量;根据GenBank中已发表的马达加斯加龙树的PEPC基因序列,设计特异性引物与荧光探针,通过检测26份供试样本,检测该方法的特异性;将样品DNA进行10倍梯度稀释,以检测实时荧光定量PCR方法的灵敏度。[结果]只有3份马达加斯加龙树样本出现典型的扩增曲线,其他23份龙树科植物无典型的扩增曲线;核酸原液与10-1～10-4倍稀释液样本均能够得到典型扩增曲线,标准曲线的决定系数（R2）为0.995,检测限量为5.2×10-3 ng/μL。[结论]该方法特异性强、灵敏度高,可有效地应用于马达加斯加龙树的鉴定。 相似文献
2.
为建立一种能快速、简便、灵敏地检测人双埃克病毒(Human Parechovirus,HPeV)SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank发表的人双埃克病毒8个基因型的参考毒株全序列,针对5′端非编码区保守序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增此靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,经过优化反应条件,建立标准曲线和融解曲线,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价;检测临床粪便样品共156份,并与常规套式RT-PCR检测结果进行比较。结果显示,建立的标准曲线Ct值与模板浓度呈现良好的线性关系(r2=0.999),融解曲线特异,检测灵敏度可达60拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍,重复性变异系数小(<1%),能特异地检测HPeV。临床样本检测结果也表明该法(检出30份)灵敏度高于套式RT-PCR(检出21份)。实验结果证明建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望成为HPeVs的分子诊断、流行病学调查等相关研究的工具。 相似文献
3.
【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法，为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列，利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物，通过优化反应条件，建立了检测BRV的RT-PCR方法，同时开展了特异性、敏感性和重复性试验，并将建立的方法应用于22份临床样品的检测。【结果】建立的方法仅能够扩增出BRV的特异性片段，对其他畜禽常见病原体无特异性扩增；该方法的灵敏度为6.86×105 copies·μL-1。对22份临床样品进行检测，检测出12份阳性样品，阳性率为54.55%。【结论】本研究建立的BRV RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可应用于临床样本的检测，为福建省BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。 相似文献
4.
刘勇 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2008,34(1):33-38
为了培育无病毒壮苗,研究了烟草漂浮苗烟草花叶病毒(TMV)的带毒率检测方法.结果表明:三抗体夹心法(TAS-ELISA)和试纸条的检测灵敏度分别为TMV病叶汁液10-6和10-4;苗期常用农药和消毒剂的药害不会引起TAS-ELISA和试纸条检测假阳性;TAS-ELISA和试纸条可检出烟苗无症带毒,在发现烟苗现症时,同盘烟苗带毒率高于发病率;在允许存在低漏检率的情况下,采用2株或3株苗样本混合检测可扩大检测覆盖面;烟苗带毒是大田普通花叶病毒病的一个主要但非惟一初侵染源. 相似文献
5.
【目的】建立基于SYBR Green I嵌合染料法的灌溉水源中沙门氏菌实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, q PCR)检测方法。【方法】以沙门氏菌侵袭蛋白A (inv A)基因为靶基因，设计1对特异性q PCR检测引物，在对q PCR反应体系和反应条件进行优化后，通过特异性实验和灵敏度实验对q PCR方法进行验证，并制作灌溉水源中沙门氏菌q PCR定量标准曲线，最后与国标方法对比检测灌溉水源中沙门氏菌污染来验证该方法的准确性。【结果】经过优化的q PCR检测方法灵敏度检测结果显示最低检测限量为1×10-1 pg·μL-1，特异性检测结果显示具有良好的特异性，干扰菌株对本q PCR检测方法无影响，所制作的q PCR扩增标准曲线在2×100～2×105 cfu·m L-1有较好的线性关系，相关系数为0.999 6，能对沙门氏菌进行准确的定量分析。该方法在与国标方法对比检测灌溉水源中沙门氏菌污染时具有同等准确性。【结论】本研究建立的基于SYBR... 相似文献
6.
[目的]了解安顺地区漂浮育苗TMV病毒发生规律以及导致大棚内发生大面积侵染的原因.[方法]于2011 ～2013年对安顺市主要烤烟种植区（县）病毒检出率、育苗点不同大棚烟苗带毒率以及TMV高发大棚周边环境进行调查.[结果]安顺市各烟区所有检测批次的样品均有一定的带毒率,不同烟区烟苗风险样品率及高风险样品率不同,其中紫云县烟苗TMV阳性检出率为历年最高.漂浮苗带毒率与育苗棚管理水平密切相关.随着育苗集约化程度提高,烟苗TMV阳性检出率提高,感染TMV的风险增大.设施不齐全、周边生态环境、育苗管理操作不到位为TMV传播提供了初侵染原和重要途径,导致烟苗带毒率大大增加.[结论]为防治烟草普通花叶病及提高烤烟的产量及品质提供了理论依据. 相似文献
7.
【目的】西瓜潜隐病毒（Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV）是近年来新发生的一种重要种传病害,研究旨在建立基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes,TaqMan-qPCR）检测技术,为开展种子、种苗带毒鉴定和病害防控提供技术支撑。【方法】通过基于小RNA高通量测序技术在北京西瓜产地发现了CiLCV,并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全长序列,设计特异性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR检测方法。以黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottled mosaic virus）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus）、甜瓜内源病毒（Cucumis melo endornavirus）、瓜类褪绿病毒（cucurbit chlorotic yellows virus）、南瓜花叶病毒（squash mosaic virus）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus）、西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus）、小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus）8种常见病毒为对照进行检测方法特异性分析;利用建立的实时荧光定量标准曲线对方法灵敏度进行评价;进一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技术监测我国葫芦科作物主产区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜（砧木）种苗带毒情况。【结果】通过分析获得的高质量小RNA数据,发现17条组装的contig与CiLCV基因组有较好同源性。进一步克隆获得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全长（分别为1 603和1 466 nt）,发现其与河南省鉴定出的CiLCV同源性高达99.4%和99.8%（GenBank number KY081285、KY081284）。建立的RT-PCR检测技术对CiLCV有单一扩增条带;建立的TaqMan-qPCR检测技术具有较好特异性和灵敏度,且能够检测到最低拷贝数为2×103的病毒,灵敏度是RT-PCR的100倍。同时,发现有1份来自北京的西瓜种苗检出了CiLCV,而其余地区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜（砧木）种苗均未检出该病毒,表明我国葫芦科作物主产区种苗带毒情况总体不高。【结论】建立的TaqMan-qPCR检测CiLCV技术特异性强、灵敏度高,适用于口岸和实验室开展CiLCV快速检测和精准鉴定。鉴于CiLCV可以通过种子、种苗等传播方式快速扩散,我国应重视种子、种苗的带毒检测,防止带毒种子、种苗流入生产环节进而调运扩散至全国,给产业造成重大经济损失。 相似文献
8.
牛冠状病毒(BCoV)在全球广泛存在，在临床上能引起牛腹泻以及呼吸道感染，给养殖业带来巨大经济损失。为快速批量检测临床样品、分析国内的BCoV隐性感染及流行情况，根据BCoV的N基因序列设计了引物和探针，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，对其特异性、敏感性、重复性进行评估，并将其与靶向BCoV的N基因的常规RT-PCR方法进行对比。利用本方法对采集自我国西藏、江苏、河北、贵州、安徽等5个省份的22个未发病牛场的35份口腔拭子样品和244份粪便样品进行检测以了解流行情况。结果表明，质粒标准品拷贝数的对数与CT值呈现良好稳定的负线性关系，标准曲线为y=-3.441 8x+39.584 0,r2=0.999 4,E=98.2%;最低检测拷贝数为6.0×10拷贝/μL,重复性变异系数均<5%;对临床样品进行检测，检出率明显高于常规RT-PCR方法。对22个牛场的279份病料进行检测，结果显示BCoV的总体阳性率为73.12%,牛场阳性率为100.00%。本研究成功建立了靶向BCoV N基因、灵敏度高、特异性好的荧光定量RT-PCR... 相似文献
9.
在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物，经特异性筛选后，获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品，建立标准曲线，同时验证该方法的灵敏度和特异性，并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物（CVA-dF2、CVA-dR2），基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高，无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量，绝对定量标准曲线斜率为-3.574 6，决定系数R2为0.998 6，扩增效率为0.904 4，比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具，可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。 相似文献
10.
植物诱导抗病剂组合应用对烟草花叶病的防控效果 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]探讨植物诱导抗病剂组合对烟草花叶病的防控效果。[方法]在模拟病圃环境下,研究了6种植物诱导抗病剂的不同组合对烤烟栽培品种红花大金元的烟草花叶病的防控效果。[结果]多肽保与AHO 2种诱导剂的组合应用对控制TMV有良好效果,能明显推迟带毒隐症烟株TMV的发病时间,移栽后70 d对以清水和东旺毒消为对照的大田期烟株TMV的平均防效分别达到69.64%和43.25%,且在株高、叶数方面表现出明显优势,叶片生长发育状况良好。烟苗携带TMV病毒与症状能否表现无直接相关性,带毒隐症烟苗只有在发病条件适宜时才会表现症状。带毒隐症烟苗栽后19 d内是TMV发病的高峰期,在育苗阶段与大田期施用有效药剂,以及移栽后促进烟苗早生快发是控制其发病的关键措施。[结论]为制定烟草花叶病的防控措施提供了理论依据。 相似文献
11.
为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。 相似文献
12.
同步检测为害非洲菊3种病毒的多重RT-PCR方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以接种番茄斑萎病毒(TSWV)的烟草和侵染烟草脆裂病毒(TRV)及烟草花叶病毒(TMV)的非洲菊为试验材料,建立了同步检测非洲菊上述3种病毒的多重RT-PCR方法.结果表明,建立的多重RT-PCR方法可一次性扩增出 3 种病毒的DNA条带,可以从RNA含量1 mg的带毒叶片中检测到混合病毒;同时对单一病毒RT-PCR的灵敏度检测表明:最低可以从RNA含量分别为1 mg、10μg和100 ng的带毒材料中检测到TSWV、TRV和TMV. 相似文献
13.
为建立特异性强、灵敏度高、重复性好的产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，本试验根据产气荚膜梭菌的plc基因保守序列设计合成特异性引物探针，摸索其最佳反应条件，进行灵敏性、特异性、重复性以及临床样本验证。结果表明：建立的方法具有较好的灵敏性、特异性及重复性，最低检出限度为8.26×101拷贝/μL，在8.26×103～8.26×108拷贝/μL的范围内具有良好的线性关系，同时不与其他致病菌发生交叉反应，组间及组内的变异系数均小于4%，应用比方法在采集的300份临床样品中检出24份阳性样品，与常规细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。说明试验成功建立了牛产气荚膜梭菌荧光定量PCR检测方法，这将为牛产气荚膜梭菌的快速诊断提供技术支持。 相似文献
14.
[目的]研究大麦、玉米秸秆还田对植烟土壤养分、常发性病害发生流行、烟草农艺性状、烟叶经济和化学性状的影响。[方法]采用田间随机区组试验,设置不还田+常规烟草复合肥(CK)、常规烟草复合肥+6 000 kg/hm2大麦秸秆还田(T1)、常规烟草复合肥+6 000 kg/hm2玉米秸秆还田(T2),测定烟株移栽后土壤化学性质、农艺性状、烟叶产量产值和化学性状并调查病害发生情况。[结果]T2处理后土壤pH、有机质、碱解氮和速效钾含量较CK分别增加了10.31%、44.19%、26.09%和130.35%,T1、T2处理促进了烟草农艺性状;田间气候斑点病、普通花叶病的发病率和病情指数均表现为CK>T1>T2,黑胫病发病率和病情指数表现为CK>T2>T1;T1、T2处理提高了烟草产量、产值和... 相似文献
15.
【目的】在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的BVDV 5'端非编码区(5'UTR)核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR方法。【结果】建立的方法只能检测到BVDV,而与猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒及牛冠状病毒没有交叉反应,具有高度的特异性;在102108copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.998,最低可检测下限可达到102copies/μL,具有灵敏度高的特点;不同情况下3次重复实验,变异系数均小于1.5%,具有重复性好的特点。【结果】成功建立了一种用于检测BVDV的实时荧光定量RT-PCR技术,并可用于临床样品的检测,适用于BVDV的快速诊断和流行病学调查。 相似文献
16.
[目的]根据DNA序列数据库上已公布的布鲁氏菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)Omp 25基因,设计一对引物和荧光探针,通过反应体系优化,建立一种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法.[方法]以构建的外膜蛋白目的片段重组质粒为标准品,验证该方法的灵敏度、特异性,通过优化反应条件,建立标准曲线.通过对34份已知临床背景的样品检测,验证该方法的敏感性.[结果]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,特异性验证符合率100％,最低检测限约为100 copies/μL,敏感度的检出率为100％,建立标准曲线的R2为0.994,扩增效率99.73％.[结论]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于布鲁氏菌的检测. 相似文献
17.
猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]建立一种定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法.[方法]用RT-PCR方法扩增PRRSV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRRSV-N基因重组质粒作为模板来进行检测PRRSV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增.[结果]PRRSV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为98.2％,标准曲线的决定系数为0.9995,可准确检测的最低核酸模板浓度为60 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性.临床检测显示,PRRS病猪的血清中PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于PRRSV亚临床感染猪.[结论]建立了一种可用于PRRSV定量检测与PRRS早期快速诊断的特异性强、灵敏度高、重复性好的PRRSV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法. 相似文献
19.
20.
【目的】建立3种大白菜病毒病多重RT-PCR检测技术,为病毒病快速检测、白菜病毒病防治与抗病育种提供参考。【方法】针对我国大白菜芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒的外壳蛋白(CP)基因保守区序列,设计特异性检测引物,从多重RT-PCR(mRT-PCR)扩增引物、Mg~(2+)浓度、Taq DNA聚合酶及dNTPs浓度、退火温度、延伸时间和循环次数等方面对RT-PCR检测技术进行优化。【结果】在dNTPs浓度为0.24 mmol/L,Mg2+浓度为2.8mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为0.12U/μL,退火温度为52℃,延伸时间为30s,循环30次,即可成功地在一个体系中对TuMV、TMV和CMV 3种病毒复合侵染的大白菜病样进行多重RT-PCR扩增,扩增得到228,305和460bp3条特异性条带,其大小与试验设计相符合。灵敏度接近单重RT-PCR(sRT-PCR),体现了多重RT-PCR的优越性。【结论】建立了能同时检测大白菜样品中TuMV、TMV和CMV的多重RT-PCR检测体系,该多重RT-PCR方法能对田间大白菜样品进行3种病毒的准确、快速、高效检测。 相似文献