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1.
《福建农业学报》2015,(10)
为检测福建省马铃薯纺锤块茎类病毒及了解其分子变异情况,以感染马铃薯纺锤块茎类病毒的植株为试验材料,提取RNA,反转录cDNA,利用设计合成的特异性引物进行RT-PCR检测,扩增产物经回收纯化后克隆和测序。结果表明,PCR扩增出359bp的特异片段,将扩增产物经回收和纯化并进行克隆与测序,测序结果经BLAST比对后,该片段为PSTVd基因序列,PSTVd分离物命名为Fujian PTSTd(KM588065.1),与国内外报道的PSTVd分离物同源性达98%以上。该分离物与弱毒株系(M14814.1)、中间株系(AY492084.1)和强毒株系(U23058.1)比对,有11个核苷酸具有多态性,其中5个发生在致病区。不同国家和地区序列进化树分析表明,该分离物与我国北方及欧美国家分离物亲缘关系最近,与新西兰分离物亲缘关系最远。 相似文献
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《云南农业大学学报(自然科学版)》2017,(5)
【目的】了解云南省马铃薯纺锤块茎类病毒分子变异情况及其致病机制。【方法】以采自云南2个不同地方疑似马铃薯纺锤块茎类病毒病的块茎为材料,对其提取总RNA、反转录为c DNA,利用特异性引物进行RT-PCR检测,扩增产物经纯化后克隆并测序。【结果】扩增产物全长357 bp,分别命名为PSTVd-DasongpingYN(KX159281)和PSTVd-Lianghe YN(KX159282)。将这2个分离物与国内外已报道的PSTVd株系全序列构建系统发育树,并与已报道的PSTVd弱毒、中毒和强毒株系进行序列比对和二级结构预测,表明PSTVd-Dasongping YN和PSTVd-Lianghe YN与PSTVd弱毒株系更接近。【结论】PSTVd-Dasongping YN和PSTVd-Lianghe YN的序列相似性为97.5%,存在9个碱基差异,且主要集中在可变区(V)和右末端区(TR),说明云南不同地方分离物PSTVd也存在差异。PSTVd-Dasongping YN和PSTVd-Lianghe YN属于PSTVd的弱毒株系组。 相似文献
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以陕西省榆林地区种植2~3代的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成一对特异引物,反转录合成cDNA,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后回收纯化扩增产物并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性。电泳结果表明,在榆林地区的马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的目的片段,说明这些马铃薯均感染了PSTVd;序列分析表明,10个不同采样点PSTVd的目的片段大小为250~251 bp,只是单个碱基之间的转换或缺失,PSTVd在榆林地区几乎没有发生变异,与国内外其他15个地区已报道的序列一致性在82.3%~99.5%之间。 相似文献
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马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viriod,PSTVd)侵染马铃薯会严重影响薯块的产量和品质。根据PSTVd的同源序列设计引物,以山西省马铃薯感病块茎中提取的总RNA为模板,经RT-PCR方法扩增出全长cDNA片段,将其克隆到质粒pBS-T载体上,进行序列分析。结果表明,该类病毒全长359 nt,能通过分子内序列互补形成致密的二级结构。以该序列作为种子序列进行Blast搜索,该序列与PSTVd荷兰分离物(GenBank登陆号:AY372400.1)的序列一致性为100%。将该序列与东北株系、河北株系及已公布的弱株系(GenBank登陆号:M14814.1)、强株系(GenBank登陆号:U23058.1)、中间株系(GenBank登陆号:AY937179.1)比对,有12个核苷酸具有多态性,其中有5个发生在致病区。将线性化的质粒pBS-PSTVd及其PSTVd的体外转录产物接种番茄矮红宝的无毒苗,20 d后接种株轻微显症,RT-PCR检测均呈阳性。将RT-PCR产物测序,其结果与接种的PSTVd原序列完全一致,证实构建的PSTVd山西分离物的克隆具有侵染性。 相似文献
5.
应用RT—PCR技术快速检测马铃薯纺锤块茎类病毒 总被引：2，自引：0，他引：2
根据马铃薯纺锤块茎类病毒序列,设计合成了一对特异性引物．以感染PSTVd的马铃薯试管苗为材料,提取其总RNA,获得纯度较高、完整性较好的总RNA．以此总RNA为模板,进行cDNA合成及PCR扩增,从感病组织中扩增得到一段约为359bp的特异RNA扩增产物,与理论设计大小一致,而健康组织无此扩增产物． 相似文献
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双向往返电泳(R-PAGE)法是检测马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的有效手段，本试验通过对该方法中马铃薯纺锤块茎类病毒核酸提取步骤的改进，提高了核酸纯度，使检测结果更为准确、清晰，且灵敏度高。 相似文献
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利用在试管中保存的马铃薯纺锤块茎类病毒（pstvd）的纯毒源,在防虫的网棚（网绷纱要求100目）中,利用金钢砂、喷粉器、棉球、研钵,将毒源中加入0．1ml磷酸缓冲液后将其研碎,接种在克新2号、克新3号、克新4号的植株上。该试验进行两次接种,第1次接种10d后,进行第2次接种．根据植株的外观表现：健康株、健康株生长势低于前者、轻束顶症株、重束硕症株来判定接种纺锤块茎症病毒后植株的发病情况,根据小区测产对比总结出马铃薯纺锤块茎类病毒对马铃薯产量影响的程度．克新2号品种减产27．2%-61．80％;克新4号品种减产17．40％-57．40％。 相似文献
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马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：1，他引：1
根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。 相似文献
10.
从采自贵州感染了啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid, HSVd）的柑桔植株中抽提总核酸,通过一对鉴别引物,经RT-PCR扩增初步筛选出柑桔木质陷孔病类病毒（Citrus cachexia viroid, CCaVd）。扩增该类病毒的全长核苷酸片段,通过克隆和测序,结果发现,该片段全长298bp,与GenBank中报道的木质陷孔病类病毒分离物同源性达到96％以上。这是中国发生的木质陷孔病类病毒的分子生物学特征的首次报道。 相似文献
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根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7N基因、猪乙型脑炎病毒（JEV）NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、
特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV0.2ng/L、JEV 0.4ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。 相似文献
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《农业科学学报》2016,(2)
China is the largest potato producing country worldwide,with this crop representing the fourth largest staple food crop in China.However,the steady presence of Potato spindle tuber viroid(PSTVd) over the past five decades has a significant economic impact on potato production.To determine why PSTVd control measures have been ineffective in China,more than 1 000 seed potatoes collected between 2009 and 2014 were subjected to PSTVd detection at the Supervision and Testing Center for Virus-free Seed Potatoes Quality,Ministry of Agriculture,China.A high PSTVd infection rate(6.5%) was detected among these commercial seed potatoes.Some breeding lines of potato collected from 2012 to 2015 were also tested for PSTVd infection,revealing a high rate of PSTVd contamination in these potato propagation materials.Furthermore,comparison of the full-length sequences of 71 different Chinese PSTVd isolates revealed a total of 74 predominant PSTVd variants,which represented 42 different sequence variants of PSTVd.Comparative sequence analysis revealed 30 novel PSTVd sequence variants specific to China.Comprehensive phylogenetic analysis uncovered a close relationship between the Chinese PSTVd sequence variants and those isolated from Russia.It is worth noting that three intermediate strains and six mild strains were identified among these variants.These results have important implications for explaining the ineffective control of PSTVd in China and thus could serve as a basic reference for designing more effective measures to eliminate PSTVd from China in the future. 相似文献
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为研究云南马铃薯A病毒(PVA)分布及其外壳蛋白的分子变异,2007年至2011年分别从云南滇西北、滇东北、滇中及滇南马铃薯种植区采集381份马铃薯样品,进行马铃薯A病毒DAS-ELISA检测,结果表明,PVA阳性样品共43份,其中滇西北22份,滇中17份,滇东北4份,滇南未检出。对带有PVA的部分样品进行电镜负染色观察,电镜下观察到长约750 nm、直径约15 nm的线状粒子。根据已报道的PVA外壳蛋白基因(cp基因)序列设计合成特异性引物,以带毒样品总RNA为模板,RT-PCR扩增得到807 bp目的片段,克隆测序并对其推导的外壳蛋白(CP)氨基酸序列进行同源性分析,并比较分析了不同地区PVA分离物CP氨基酸序列分子变异。结果表明,云南不同地区PVA分离物与GenBank中登录的部分PVA分离物CP氨基酸序列同源性为93.3%～100%,依据不同PVA分离物CP氨基酸序列构建系统进化树,云南PVA分离物与中国福建分离物(AF483279)亲缘关系较近,形成一个进化簇。PVA不同分离物CP氨基酸序列分子变异分析表明,不同分离物CP氨基酸变异位点主要分布在氨基酸序列的N端。 相似文献
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以陕北地区8个县(区)种植2~3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯Y病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计1对特异引物,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增目的 DNA片段,1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。回收纯化CP基因片段并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性。结果显示,所有马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的、长度为400 bp的目的片段,表明这些马铃薯均感染了Y病毒;陕北8个县(区)马铃薯Y病毒CP基因与国内外其他地区12个样品之间的序列一致性为88.4%~99.8%,表明马铃薯Y病毒的CP基因序列比较保守,不易发生变异。RT-PCR方法可快速、准确地检测马铃薯Y病毒,从而为马铃薯茎尖剥离脱毒生产脱毒种苗(薯)提供依据。 相似文献
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为研究病毒和类病毒在马铃薯试管苗不同部位的积累规律,利用实时荧光定量PCR和DAS-ELISA两种方法检测马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid, PSTVd)、马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus, PLRV)和马铃薯S病毒（Potato virus S, PVS）在马铃薯试管苗基部和顶端继代培养5代（继5代）后的含量。结果表明：PSTVd,PLRV和PVS在马铃薯试管苗常规组织培养过程中是逐代传递的,其在马铃薯试管苗顶端和基部的积累规律存在显著的品种差异,分别供试的7个品系中,存在PSTVd顶端积累和基部积累效应的各3个品系,存在PLRV顶端积累和基部积累效应的分别为4个和2个品系,存在PVS顶端积累和基部积累效应的分别为3个和2个品系,其中PSTVd的顶端积累效应最强为基部的4倍;同一马铃薯品系的顶端和基部对不同病毒和类病毒的积累趋势相对一致。实时荧光定量PCR是一种灵敏度很高的定量检测马铃薯病毒和类病毒的方法。 相似文献