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1.
为建立鸭血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量检测方法,首先利用纯化的鸭ACE2重组蛋白,成功制备了兔抗鸭ACE2多克隆抗体,间接ELISA法确定抗体效价为1∶800;然后利用制备的鼠抗鸭ACE2多克隆抗体作为捕获抗体,通过戊二醛二步法对兔抗鸭ACE2多克隆抗体进行HRP标记,并将HRP标记的兔抗鸭ACE2多克隆抗体作为检测抗体,纯化获得的鸭ACE2重组蛋白作为标准品,建立鸭ACE2双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对抗体浓度、捕获抗体最适包被条件、孵育条件、封闭条件及显色条件等进行优化;通过Western blot法检测正常白鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织间ACE2表达的变化;利用RT-qPCR方法检测正常鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织中ACE2基因的相对表达量。结果表明：所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测浓度为5 ng·mL-1,最佳线性范围为25～1 600 ng·mL 相似文献
2.
为建立检测草鱼白介素10(CiIL-10)的双抗体夹心 ELISA方法,首先克隆CiIL-10基因、构建与表达原核表达重组质粒pET-32a-CiIL-10,并对表达产物进行纯化,以获得重组CiIL-10(rCiIL-10)纯化蛋白.然后,以纯化的rCiIL-10蛋白为免疫原制备兔源及鼠源抗rCiIL-10的多克隆抗体,并对其进行纯化与酶标记.最后,以纯化的鼠抗rCiIL-10抗体为捕获抗体,rCiIL-10纯化蛋白为夹心抗原,HRP标记的兔抗CiIL-10纯化抗体为检测抗体,通过优化反应条件,建立双抗体夹心 ELISA检测方法.结果显示,该方法的优化反应条件包括,捕获抗体的最佳包被浓度为20μg·mL-1,检测抗体的最佳稀释度为1 ∶ 3 200,最佳封闭条件是使用5％脱脂奶粉,37℃封闭1.5 h,样品反应时间为2 h,以OD450值≥0.174作为阳性判定标准.该方法的板内及板间重复性变异系数小于10％,最低检测限量为24.29 ng·mL-1,与草鱼白介素6、草鱼肿瘤坏死因子、小鼠白介素10、小鼠干扰素和小鼠单核细胞趋化蛋白均无交叉反应.结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有较好的特异性、重复性和灵敏度,可用于草鱼白介素10的快速检测. 相似文献
3.
禽流感(H9N2亚型)酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
采用AIV灭活油乳苗（H9N2）对AIV非免疫鸡进行接种并获取高免血清，取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法，经过Sephadex G25层析柱提纯后可获得纯度很好的IgG。将IgG应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶（HRP），制备禽流感酶标抗体（IgG—HRP），利用所提取的AI—IgG和所制备的禽流感酶标抗体按照双抗夹心Dot—ELISA试验操作步骤，采用方阵法分别摸索包被抗原及酶标抗体的最佳浓度，以及各步反应时间等最佳反应条件，以建立一种优化的AIV双抗夹心Dot—ELISA检测法。结果表明，所制备的AI高免血清HI效价为10log2；AI酶标抗体克分子比值为2．45；优化的Dot—ELISA各条件为：包被AI—IgG最佳稀释倍数为1：50；最佳封闭剂为1％牛血清白蛋白；AI酶标抗体最佳稀释倍数为1：100；待检抗原与2种抗体的感作时间均为0．5h（37℃）。优化后的检测方法可在2．5h内诊断结果。制备好的包被膜在4℃下保存2个月不影响其效果。而且敏感性提高了3倍，与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应。 相似文献
4.
罗非鱼无乳链球菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
通过杂交瘤技术制备抗罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白单克隆抗体2株:1C9和6G5,均为IgM,效价分别为10-5和10-4,间接ELISA结果显示单克隆抗体1C9对无乳链球菌具有良好的检测特异性和灵敏性;同时制备兔抗罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白多克隆抗体及其HRP酶标记物,兔抗SIP蛋白多克隆抗体的效价为10-6,经标记的抗体效价为10-4,最佳抗体工作浓度为1:400.建立双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测罗非鱼无乳链球菌的方法,具良好的特异性,检测灵敏度为0.85×106 CFU· mL-1.双抗体夹心ELISA检测实际应用结果与双重PCR检测比较,相对符合率为98.33％,检测结果可靠性高. 相似文献
5.
本文应用辣根过氧化物酶标记抗仙台病毒的单克隆抗体,建立了抗体夹心法检测小鼠体内仙台病毒抗体的方法,与间接 ELISA 进行比较,检出率提高6%左右,敏感度提高四倍以上。样本结果的变异系数小于10%,重复性良好。直接用酶标记单克隆抗体有简便、廉价、生物活性高等优点。 相似文献
6.
间接ELISA法检测羊促乳素抗体方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立促乳素单克隆抗体制备中筛选阳性分泌细胞的间接ELISA检测方法。【方法】用促乳素纯品与Freund佐剂免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,初次免疫采用抗原与完全Freund佐剂,每2周免疫1次,从第2次开始采用抗原与不完全Freund佐剂,免疫4次后尾静脉采血,收集血清制备阳性对照抗体,以未免疫的BALB/c小鼠血清为阴性对照,筛选间接ELISA法检测促乳素抗体的最佳反应条件,并对单克隆抗体制备中的阳性细胞进行筛选。【结果】间接ELISA法的最佳反应条件:血清稀释倍数为1∶200,抗原包被质量浓度为100 ng/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白,酶标抗体的工作浓度为1∶10 000,酶标抗体作用时间为37℃90 min,底物作用时间37℃30min。用该方法检测融合的杂交瘤细胞,最终获得OD450为0.875和0.460的阳性细胞株。【结论】建立了检测促乳素抗体的间接ELISA检测方法,该方法方便易行。 相似文献
7.
牛乳过敏原β-乳球蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立 总被引：4，自引：1，他引：3
检测牛乳中的主要过敏原β-乳球蛋白,利用β-乳球蛋白纯品免疫新西兰白兔,制得兔抗牛β-乳球蛋白的多克隆抗体,以β-乳球蛋白包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗、四甲基联苯胺(TMB)为底物,建立了牛乳中β-乳球蛋白的间接竞争酶联免疫检测法(ELISA).确定了包被抗原质量浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释度为1∶6 400,酶标二抗稀释度为1∶10 000.结果达到批内误差3.87%,批间误差6.51%;检测的线性范围为0.05～1.00 μg/mL,标准曲线回归方程y=-1.930 2x-0.124 1,相关系数为0.994 5,说明所建立的方法灵敏度高,具有良好的准确性和重复性. 相似文献
8.
己烯雌酚酶联免疫检测方法的建立 总被引：4，自引：0，他引：4
建立灵敏度高和特异性强的己烯雌酚残留检测分析方法。用人工合成的己烯雌酚免疫原多次免疫家兔,获取高效价抗体。纯化抗体经生物素标记,可同辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素特异结合。采用纯化的抗体包被96孔板,形成固相抗体。加入不同浓度的己烯雌酚标准品后,再加入生物素标记抗体,以酶标记亲和素作为探针,经酶底物显色反应可获得良好的ELISA标准曲线。该方法检测灵敏度为0.125 ng/mL,可定量检测范围为0.25~15.60 ng/mL。该方法操作简便,具有较强灵敏度和特异性,可满足实践中一般样品的残留检测。 相似文献
9.
双抗夹心酶联免疫分析法检测食品中鸡蛋过敏原 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]建立食品中鸡蛋过敏原的酶联免疫检测方法。[方法]以卵白蛋白为检测对象,分别制备抗卵白蛋白的多克隆和单克隆抗体。将单克隆抗体作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记多克隆抗体为二抗构建卵白蛋白的双抗夹心ELISA方法。[结果]该方法的IC50为260 ng/ml,检出限为10 ng/ml,样品的添加回收率为84.2%～89.8%,相对标准偏差小于10%。[结论]该试验建立的分析方法稳定可靠,能满足食品中鸡蛋过敏原准确、快速的检测需要。 相似文献
10.
11.
Yuelan Zhao Yuzhu Zuo Lei Zhang Jinghui Fan Hanchun Yang Jianhua Qin 《Frontiers of Agriculture in China》2009,3(3):325-331
The IgG antibodies of rabbit anti-E2 protein of the bovine viral diarrhea virus were prepared by a general method from high
efficiency serum immunized by E2 recombinant protein antigen expressed in E. coli prokaryotic expression system and were labeled to make enzyme-labeled antibody with the method of NaIO4. A sandwich Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of BVDV was developed. The optimal reaction
conditions of Dot-ELISA were determined. The results show that optimal coating antibody was 300 μg·mL−1, the working concentration of HRP-labeled antibody was 1:50. The optimal blocking reagent and time were 5% bovine serum and
45 min. The minimum detection of the content of antigen reached 1.35 μg·mL−1. Compared with the routine IDEXX ELISA test kit with the whole virus, its specificity, sensitivity and coincidence rate were
90.48%, 96.55% and 95.24%, respectively. Compared with the sandwich Dot-ELISA with the negative staining electron microscope
and RT-PCR, the coincidence rates were 90.9% and 93.1%, respectively. In addition, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) antigen
of 178 samples collected from cow farms in the Hebei Province, China, were detected by the developed Dot-ELISA and the IDEXX
BVDV antigen Test Kit simultaneously, BVDV antigen positive rate was 39.89%–41.01%. The result of detecting clinical samples
demonstrated that the established method showed its specificity, sensitivity and repeatability, whereas the results were easily
interpreted without an ELISA reader. 相似文献
12.
对2012-2016年烟台市售生乳、发酵乳、灭菌乳、全脂乳粉和婴幼儿配方乳粉5种乳及乳制品中的铅(Pb)、镉(Cd)、总汞(Hg)及总砷(As)含量进行测定.采用单因子污染指数法和内梅罗综合污染指数法,对其污染程度进行分析评价.结果表明:乳制品中铅(Pb)、镉(Cd)、总汞(Hg)和总砷(As)的检出率分别为58.69%(125/213)、36.62%(78/213)、3.29%(7/213)、2.82%(6/213),发酵乳和婴幼儿配方乳粉中总Hg和总As未检出,全脂乳粉中总As未检出.生乳、发酵乳和灭菌乳等液态乳Pb的检出率和单因子污染指数均最高;全脂乳粉Pb的检出率最高,Cd的单因子污染指数最高;婴幼儿配方乳粉中Cd的检出率最高,而Pb的单因子污染指数最高.生乳中重金属污染程度最高,P综合=0.292,全脂乳粉综合污染指数最低,P综合=0.087 6,各类乳制品的综合污染指数从大到小排序为生乳﹥发酵乳﹥灭菌乳﹥婴幼儿配方乳粉﹥全脂乳粉.生乳、发酵乳和灭菌乳重金属污染物主要为Pb,全脂乳粉和婴幼儿配方乳粉为Pb和Cd.生乳的综合污染指数较高. 相似文献
13.
牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(LF)含量的竞争ELISA检测方法。[方法]制备鼠抗牛LF单克隆抗体,采用直接竞争ELISA测定酶标记物效价,建立牛LF的直接竞争ELISA检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛LF单抗效价达1∶1 280 000,且鉴定为IgG1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640 000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/ml和1∶40 000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2 h的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25~1 000 ng/ml浓度范围内,牛乳铁蛋白的logit(B/B0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y=-1.899 1x+5.043 3(R2=0.987 3)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。 相似文献
14.
常乳中牛乳铁蛋白的纯化及抗菌活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究从常乳中纯化牛乳铁蛋白的工艺条件,探讨牛乳铁蛋白的抗菌活性。[方法]选用SP sepharose HP作为强阳离子交换介质,利用AKTApurifier10高效液相色谱仪纯化牛乳铁蛋白。[结果]结果表明,牛乳铁蛋白在pH值7.5、浓度0.85 mol/L的NaCl洗脱液中可以被洗脱下来,且产品纯度为90%以上。牛乳铁蛋白浓度为5 mg/ml时对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用。[结论]该研究建立了从常乳中纯化牛乳铁蛋白的方法,为大规模生产具有活性的牛乳铁蛋白奠定了基础。 相似文献
15.
[目的]鉴于婴幼儿食品的特殊性和重要性,对婴幼儿配方奶粉中的铁、锌元素含量进行测定。[方法]采用干法灰化法处理6种婴幼儿配方奶粉,探究适合奶粉灰化的温度,并且用火焰原子吸收光谱法测定奶粉中铁、锌元素的含量。[结果]试验表明,测定铁、锌元素含量时奶粉的灰化温度为450～500℃;同一厂家生产的同一品牌不同成长阶段的婴幼儿配方奶粉,铁含量存在一定的差异,锌含量存在显著性差异,同一厂家生产的不同品牌的婴儿(较大婴儿)配方奶粉,铁、锌含量均不存在显著性差异,不同品牌幼儿配方奶粉的铁、锌含量存在显著性差异;6种奶粉的铁、锌元素含量均符合国家标准GB/T5413.21-1997。[结论]科学全面地评价婴幼儿配方奶粉中铁和锌元素的含量,对评价奶粉的品质以及正确引导消费者消费具有积极的现实意义。 相似文献
16.
通过对包被单抗和酶标单抗以及抗原最佳工作浓度的优化,建立草鱼肠型点状产气单胞菌双抗夹心ELISA试剂盒检测体系。用分光光度法对检测体系的特异性、稳定性和灵敏度进行测定;用脱脂奶平板法对试剂盒的临床应用进行检测。结果表明,单抗最适稀释液为pH9.4的碳酸盐缓冲液,洗涤液为含φ=0.05%Tween-20的PBS,包被单抗最适体积稀释倍数为1∶800,酶标单抗最适体积稀释倍数为1∶6 000,抗原最佳工作浓度为3×104cfu/mL。试剂盒与肠型点状产气单胞菌有特异性反应,脱脂奶平板法与试剂盒法对草鱼患病检出率基本一致,符合率达90%;试剂盒有很好的储存稳定性,检测灵敏度为7×103cfu/mL。 相似文献
17.
18.
建立了基于量子点标记技术的赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)双抗夹心荧光免疫检测(sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay,sFLISA)体系,包含多克隆包被抗体、生物素标记的多克隆检测抗体、量子点标记的链霉亲和素等,获得了sFLISA的最佳操作参数:包被抗体浓度2.5μg/mL,检测抗体稀释500倍,量子点标记链霉亲和素稀释100倍。该方法在OTA浓度3.125~125μg/L之间时,相对荧光强度和OTA浓度呈线性关系,回归方程为y=0.0206x+0.2018,R2=0.9924;加标回收率在90.1%~110.0%之间,变异系数均小于10%,能较好地进行赭曲霉毒素A的定量检测。 相似文献
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【目的】 为预防和降低黄曲霉毒素污染,在前期探明黄曲霉毒素产毒菌株鉴别标识性分子PO8蛋白的基础上,欲研究建立高灵敏、大容量反应体系的双抗夹心ELISA检测技术,为污染源头监控提供技术支撑。 【方法】 用干菌丝作标识性分子PO8蛋白的参考物,以高压均质制得的黄曲霉菌裂解液为检测抗原,纯化后的PO8-VHH作包被抗体,产毒菌株多抗作检测抗体,抗原、抗体分别以200 μL/孔加入到96孔酶标板,进行大容量反应体系夹心ELISA法的试验。优化相关理化因素,以阳性孔OD450nm≥1.0,阳性孔OD450nm/阴性孔OD450nm较高为原则,确定最佳试验条件,建立标准曲线。并通过样品添加回收试验、重复性试验、特异性试验,对建立的夹心ELISA方法进行性能评估。 【结果】 通过棋盘格试验确定了最佳包被抗体浓度为3.0 μg?mL -1,最佳多抗的工作浓度为2.5 μg?mL -1。优化反应条件确定：最佳抗体包被条件为4℃过夜,最佳封闭液为3%的BSA,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,最佳多抗作用条件为37℃反应50 min。在优化后的条件下建立了夹心ELISA方法的标准曲线,对黄曲霉菌检测限可达到0.1 μg?mL -1,比前期报道的常规容量反应体系灵敏度提高了约10倍。该方法特异性强,与青霉菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、赭曲霉菌均无交叉反应,且检测非产毒黄曲霉菌株信号值较低,接近于阴性值。重复性试验显示,板间变异系数为1.5%—5.8%,板内变异系数为0.4%—3.2%,均小于7%,说明该方法稳定性好。采用该方法对花生、玉米等农产品进行添加回收试验,平均回收率在81.9%—109.0%。 【结论】 本研究建立的大容量反应体系夹心ELISA方法可快速、高灵敏地检测黄曲霉毒素产毒菌,为从源头上控制黄曲霉毒素污染提供了新的快速、方便的检测技术支撑。 相似文献
20.
【目的】建立诺氟沙星（norfloxacin,Nor）免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒（Nor-kit）,并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50 为5.18 μg•L-1,灵敏度为0.31 μg•L-1,检测限为1.00 μg•L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异系数也小于10%;在4℃保存条件下,试剂盒可以保存6个月而质量不变。奶样添加回收试验,试剂盒与LC-MS/MS测定结果没有显著差异（P≥0.05）;而且检测实际生产中鲜奶样时,试剂盒与LC-MS/MS测定结果也无显著差异（P≥0.05）。【结论】本研究成功研制出灵敏、特异、简便的诺氟沙星残留检测ELISA试剂盒。 相似文献