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1.
菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因同源片段的克隆与序列分析 总被引：5，自引：0，他引：5
在盐和干旱等渗透胁迫条件下,一些植物会积累甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)作为渗透调节物质,甜菜碱在植物体内由胆碱经两步氧化形成,催化这两步反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(cholinemonooxyge-nase,CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,BADH)。由于甜菜碱的合成途径简单,进行遗传操作方便,在诸多抗逆性基因中甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因。其中,BADH基因的全长cDNA序列首先被从藜科植物菠菜(Spinaciaoleracea)中克隆到,此后人们相继以该基因为参照,研究其它植物中的BADH基因。本文作者在以菠菜BADH基因为对照研究菊科植物的BADH基因时,根据已发表BADH基因的保守区序列设计了一对PCR兼并引物,以菠菜基因组DNA为模板,采用PCR法扩增出长分别为825bp(seq1)和822bp(seq2)的两个DNA片段,经测序和序列分析,seq1与GenBank中登录的菠菜BADH基因的基因组序列(U69142)一致,其外显子区与已发表的该基因的cDNA序列(M31480)一致,seq2与U69142序列的同源性为68%,其外显子区与M31480序列的同源性为83.93%。而且,在由该核苷酸序列推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP,说明该基因为菠菜BADH基因的同源基因。根据现有文献分析,菠菜中可能存在两个BADH的同工酶,作者所克隆基因片段所属的基因可能编码菠菜BADH的另一个同工酶。该序列已在GenBank中登录,登录号:DQ070842。 相似文献
2.
农杆菌介导的辽宁碱蓬胆碱单氧化酶基因CMO转化烟草提高抗氧化胁迫的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
通过农杆菌介导的遗传转化,将来自辽宁碱蓬的甜菜碱合成关键基因－胆碱单氧化酶基因CMO
转入烟草,以提高烟草耐受氧化胁迫的能力,并对得到抗生素抗性植株进行了分子检测和百草枯诱导
的氧化胁迫。Southern 和Northern 检测表明CMO 已经整合到烟草基因组中,并得到了正确的表达,但
不同转基因株系中的拷贝数不同,株系T1、T2、T6 为单拷贝;株系T4、T5 为双拷贝;株系T3 为3 个拷
贝。在10 μM 和20 μM百草枯胁迫24 h 的情况下,转基因植株表现了较强的耐受氧化胁迫能力,各转
基因株系和野生型相比具有较低的丙二醛含量和较高的超氧化物歧化酶活性。这可能是转基因植物
中甜菜碱的积累诱导或保护了抗氧化酶的活性,使得转基因植株受到的氧化胁迫较低,转基因植株中
较低的电导率也证明了这一点。转CMO 基因烟草耐氧化胁迫能力的提高,说明CMO 基因可以进一步
在玉米、水稻等重要农作物中应用以提高其耐受干旱、低温等非生物胁迫的能力。 相似文献
3.
高等植物中甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成,其中由胆碱单加氧酶(CMO)催化第一步氧化反应,甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化第二步氧化反应.采用生物信息学技术和RT-PCR的方法从水稻幼苗组织中分离得到了水稻CMO基因的cDNA克隆,将其命名为OsCMO.该基因含有10个外显子和9个内含子,其开放阅读框编码一条长为410个氨基酸残基的多肽,与拟南芥、山菠菜、苋、碱蓬和甜菜等植物的胆碱单加氧酶的氨基酸序列的一致性50%～62%.mRNA分析表明OsCMO基因在水稻幼苗组织中的表达受高盐、低温和干旱等胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在抵御非生物胁迫中发挥重要作用. 相似文献
4.
为了明确花生AhPLDα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制,以ABA处理的冀花4号花生叶片c DNA为模板,用RT-PCR方法扩增AhPLDα1和AhPLDα2的全长CDS片段,采用酶切-连接的方法分别将这2个基因定向克隆到植物表达载体p Bar-F3上,冻融法将重组子转入根癌农杆菌GV3101,利用改良Floral-dip法将过表达质粒转入拟南芥。菌落PCR和酶切结果表明,Ca MV35S启动子驱动的过表达载体重组质粒p Bar-AhPLDα构建正确。通过RT-PCR和qRT-PCR验证,表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达,获得了阳性转基因纯合株系。干旱胁迫试验表明,转基因植株的耐旱性较野生型明显增强。可见,AhPLDα基因参与了干旱胁迫应答过程,是转基因途径提高作物耐旱性的潜在候选基因。 相似文献
5.
pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
将载体pCAMBIA2300-35s-OCS进行改造,增加了酶切位点Sac Ⅰ,之后,PCR扩增编码胆碱脱氢酶(CDH)的基因并用Sma Ⅰ和Xba Ⅰ将其与改造后的pCAMBIA2300-35s-OCS连接,得到单价植物表达栽体p2300-gz-betA.再通过Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、Sac Ⅰ等酶切位点将编码甜菜碱醛脱氧酶(BADH)的基因及其启动子和终止序列连接到栽体p2300-gz-betA上,最终得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体,并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404.betA和BADH是编码甜菜碱合成途径的两个关键酶的基因(CDH和BADH),也是近年来研究较多的耐盐基因,其双价植物表达栽体应用于遗传转化后,有望进一步提高转基因植物的耐盐性. 相似文献
6.
盐角草甜菜碱合成相关基因的共表达提高转基因烟草的耐盐性 总被引：1，自引：0，他引：1
植物在逆境下能合成甜菜碱,其中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（PEAMT）和胆碱单加氧酶（CMO）是甜菜碱合成过程中的关键酶。本文将盐角草SePEAMT基因、SeCMO基因以及烟草的核基质结合区序列（Mar）利用Cre/loxP重组系统构建到同一表达载体上,得到植物表达载体pYLTAC747N-Mar-SePEAMT-SeCMO-Mar。该载体用电击转化法转入农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR检测确定转基因植株。在含250mM NaCl的MS培养基上35d后,转基因植株生根而野生型植株不能生根;转基因烟草植株甜菜碱积累量显著高于野生型植株,约是野生型植株的5.6~7.7倍;转基因植株与野生型相比,相对电导率显著降低,叶绿素含量明显升高。以上结果表明共表达SePEAMT 和SeCMO能有效提高烟草甜菜碱表达量从而提高烟草的耐盐性。 相似文献
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转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性 总被引：9，自引：0，他引：9
将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因与组成型启动子CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达质粒pBIBB。通过根癌农杆菌介导将BADH基因导入烟草,经PCR、Southern杂交、Northern杂交证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性,结果显示对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1~1.0 U mg-1间。转BADH基因的烟草在盐胁迫和聚乙二醇（PEG）胁迫条件下生长状态良好,生长势强于未转基因植株,说明BADH基因能在异源植物中正常翻译、表达和用于植物抗旱、耐盐基因工程的研究。 相似文献
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转betA基因的小黑杨花粉植株耐盐性分析 总被引：5，自引：0，他引：5
甘氨酸甜菜碱是植物细胞内一种重要的调渗物质,盐胁迫下,甘氨酸甜菜碱的积累可以保护细胞内蛋白质的结构和功能,降低细胞水势,从而增强植物自身的耐盐能力。从大肠杆菌中克隆的胆碱脱氢酶基因(betA)是甘氨酸甜菜碱合成的关键酶基因,该基因编码的胆碱脱氢酶(CDH)可将胆碱一步合成为甜菜碱。本实验室已将胆碱脱氢酶基因(betA)转入到小黑杨花粉植株基因组中,并最终获得了4个转基因株系。本研究以4个转betA基因株系(TB1、TB2、TB3、TB4)及非转基因对照为试材,在浓度为1.2%的NaCl盐胁迫下,测定其甜菜碱含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量,并调查试材的盐害情况,计算盐害指数,目的是为了研究转基因株系的耐盐效果,从中筛选出耐盐能力较强的转基因株系。试验结果表明,4个转基因株系的甜菜碱含量均高于非转基因对照;在1.2%NaCl胁迫下TB1、TB2、TB4的超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性均高于非转基因对照,TB3低于对照;TB1、TB4的丙二醛含量低于对照,TB2、TB3与对照相近。进一步的盐害分析表明4个转基因株系中的TB1和TB4株系的盐害指数低于对照的42.1%和33.4%,TB2、TB3与对照无显著差异。综合各转基因株系的耐盐性及生理指标测定结果,4个转基因株系中,TB1、TB2的耐盐性明显优于对照,有希望用于盐碱地造林及推广。 相似文献
9.
10.
9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物内源脱落酸(ABA)生物合成的限速酶,由NCED基因家族编码,水稻中响应干旱胁迫并以此调节ABA水平的OsNCED基因尚见未报道。本研究发现在水稻已报道的5个OsNCED基因中,OsNCED3的表达受干旱胁迫诱导,复水处理后其表达快速下调,其表达模式与此过程中内源ABA含量变化趋势一致。OsNCED3的RNAi转基因植株表现为干旱敏感,且生物量下降;而过量表达OsNCED3基因增加了水稻的抗旱性。干旱胁迫下过量表达OsNCED3的转基因株系有较高的ABA水平,同时其抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,以及逆境响应基因脱水素蛋白(Dehydrin)和胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)转录表达均高于野生型。下调表达OsNCED3的转基因株系则呈现相反的变化趋势。因此,OsNCED3是水稻干旱胁迫响应基因,调节了干旱环境下ABA水平和抗逆性。 相似文献
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rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究 总被引：4，自引：0，他引：4
根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础. 相似文献
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从上西早生(Uenishiwase)柿叶片中,提取了基因组DNA。以基因组DNA为模板,经PCR扩增,克隆到一个549 bp的ETR5的DNA片段。序列分析表明,上西早生柿基因与洋梨ETR5的核苷酸同源性为79.0%,氨基酸同源性为81.0%;并且含有其他植物ETR5的保守氨基酸区和不变氨基酸残基,表明克隆到的序列是上西早生柿ETR5的基因片段。设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,连接到植物表达载体pBI221上,构建成Uenishiwase-ETR5基因的植物表达载体。 相似文献
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山菠菜胆碱单加氧酶基因对棉花的遗传转化和耐盐性表达 总被引：13，自引：0，他引：13
胆碱单加氧酶（CMO）是渗透保护剂甜菜碱生物合成的关键酶之一。以棉花（Gossypium hirsutium L.）泗棉3号的下胚轴切段为外植体，利用农杆菌介导法将克隆自山菠菜（Atriplex hortensis）的AhCMO基因导入其中，通过组织培养胚状体发生途径获得转基因再生植株。以0.5%卡那霉素对再生苗筛选后，PCR检测抗卡那霉素棉苗确认阳性转化株，Southern和Northern杂交结果进一步证实外源基因已导入棉花并得到表达。在温室盆栽条件下，于2片真叶期对转AhCMO基因棉花及其转化受体泗棉3号施加0.5%的NaCl胁迫，15 d后发现其光合作用和植株生长被显著抑制，非转基因棉花泗棉3号的株高、鲜重和光合速率分别降低了57.6%、65.6%和69.9%，而转AhCMO基因的棉株分别降低了37.3%、54.6% 和47.9%。转AhCMO棉花所受盐害程度显著小于非转基因的棉株，说明AhCMO基因的导入和表达提高了转基因棉花的耐盐性。 相似文献
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几种植物白藜芦醇合酶基因保守序列的克隆与分析 总被引：1，自引：1，他引：0
根据GenBank中登录的一些植物的白藜芦醇合酶基因(resveratrol synthase,RS)保守序列设计引物,采用PCR技术从葡萄科植物(蛇葡萄、三叶爬山虎、五叶爬山虎和云南爬山虎)、桑科植物(桑树)和豆科植物(花生)的幼嫩叶片中扩增出该基因的DNA片段。测序结果表明,片段长635 bp,6个片段均不含内含子,分别编码211个氨基酸,均包含白藜芦醇合酶基因的特异片段和芪合酶(stilbene synthase,STS)家族特异性信号序列。 相似文献
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高转录活性籽粒特异性启动子可调控目的基因在植物籽粒中特异性、高水平表达。为发掘玉米籽粒特异性启动子，以公开发表的玉米表达谱芯片数据为切入点，筛选出籽粒优势表达基因GRMZM2G006585,克隆其编码区上游约2 000 bp的DNA序列，命名为PZm2G006585。利用在线网站New PLACE和PlantCARE对其进行启动子顺式作用元件分析，发现其含有E-box、P-box等多个籽粒特异性相关元件，初步认为所克隆编码区上游序列为玉米来源的籽粒特异性启动子。为验证其功能，构建该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表达载体并进行植物遗传转化。转基因水稻的GUS组织化学染色结果表明，该启动子驱动外源基因表达模式为籽粒特异、胚优势表达；转基因拟南芥单拷贝株系T3种子中GUS活性检测结果显示，PZm2G006585驱动的GUS活性为909.52 nmol/(min·mg)。籽粒特异性启动子PZm2G006585的发掘和功能验证为驱动目标基因在玉米、水稻等单子叶植物籽粒中特异性表达提供了候选启动子资源。 相似文献
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《种子》2020,(5)
12-氧-植物二烯酸还原酶是茉莉酸生物合成途径的一个关键性酶,广泛参与植物生长过程中生物与非生物胁迫。本研究主要探讨OPR基因在植物非生物胁迫中的作用。从水稻中克隆了OPR基因,该基因的cDNA编码区全长1 203 bp,编码400个氨基酸,将其连接到植物表达载体pSH 737上,通过农杆菌介导的方法,将含有目的基因的载体遗传转化烟草,获得31株转基因植株。选取生长状况基本一致的8株不同转基因株系和4株野生型烟草,在非生物胁迫下,用300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液浇灌处理,观察植株生长并对抗镉能力进行初步分析;选取T 1代3个转基因株系(TP 7、TP 8和TP 12)和野生型烟草的种子,放入含有3个不同浓度CdCl_2溶液的滤纸上萌发进行镉胁迫并统计发芽率。在300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液胁迫15 d后,种子发芽率比野生型高40%以上,转基因烟草的抗氧化酶活性显著高于野生型,丙二醛的含量显著低于野生型植株。利用RT-PCR方法分析相关基因表达情况,结果表明,在Cd~(2+)胁迫下,OPR,Snakin-2和GRP-2基因表达均上调,因此推测OPR基因的高表达是其具有高抗性的主要原因。OPR基因的过量表达使烟草提高了对重金属Cd~(2+)的抗逆性能力。 相似文献
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为了解大豆ClassⅠ几丁酶基因(Chitinase gene)对不同胁迫响应的分子机制。利用PCR技术克隆了大豆ClassⅠChitinase基因的启动子片段(Gm CHI1p),序列分析表明,扩增片段(1 641 bp)与Gen Bank中的已知序列同源性达99.8%,且含有多个胁迫响应调控元件。利用GUS基因上游无启动子的表达载体p CAMBIA1391Z,构建GmCHI1p与GUS基因融合的植物表达载体pCAM-Gm CHI1p,并通过农杆菌介导法导入烟草中。在转基因烟草愈伤组织中检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。对转基因烟草中的GUS活性进行初步定性分析,结果表明,GmCHI1p可驱动GUS基因在转基因烟草的根部特异性表达,而且在伤害处理的叶片中检测到GUS的强烈表达,表现出明显的根组织特异性及伤害诱导性。这种伤害诱导仅在伤害组织部位及其附近高效表达而没有被长距离传递,预计该启动子在转基因抗虫分子育种中具有巨大的应用前景。 相似文献
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根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。 相似文献
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DOF (DNA binding with one finger)转录因子是植物特有的转录因子家族,含有一个独特的富含Cys残基的单锌指DNA结合区域,在植物生长发育中参与多种生物学过程。本研究根据拟南芥AtDof1.7基因(GenBank登录号为AT1G51700)序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,以拟南芥总DNA为模板,扩增AtDof1.7基因片段,将AtDof1.7基因正向反向分别插入表达载体的相应位置,构建成AtDof1.7基因的RNA干扰载体pADOF1。利用改良的floral-dip方法将干扰载体pADOF1成功转入野生型拟南芥,经草甘膦抗性筛选和PCR检测获得5株阳性转基因植株。利用RT-PCR技术和气相色谱法分别分析了AtDof1.7基因的表达和种子脂肪酸组成,结果表明5株转基因植株中AtDof1.7基因的表达量不同程度低于野生型植株,种子油酸含量明显上升,亚麻酸含量明显下降,说明AtDof1.7转录因子与拟南芥种子脂肪酸代谢途径有一定的关系,为进一步研究其在脂肪酸代谢过程中的调控作用以及在油菜中研究该类转录因子的功能奠定了基础。 相似文献
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植物热激蛋白是一类代表性高温响应蛋白。以玉米种质POB21为材料,克隆了一个CDS序列长度为477 bp的小分子热激蛋白基因。该基因编码的蛋白含158个氨基酸,具有HSP20蛋白典型的ACD结构域,预测的等电点为5.36,分子量为17.746 k D,被命名为Zm HSP17.7。在水稻、拟南芥等植物基因组中都有其同源基因,进化和亚细胞定位分析表明,此基因属CI类小分子热激蛋白家族成员。Northern杂交分析表明,高温快速诱导Zm HSP17.7基因表达,15%PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达,但在复合胁迫下干旱增强了高温的诱导效果。外源ABA也不影响该基因的表达。与野生型拟南芥相比,超表达Zm HSP17.7的转基因拟南芥在种子萌发和植株生长过程中表现出更强的高温和干旱耐受性,说明该基因可以在植物防御高温、干旱及复合胁迫中发挥一定作用。 相似文献